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雞新城疫病毒IgA抗體（NDV-IgA）ELISA試劑盒使用方法
閱讀：149 發(fā)布時間：2018-8-7| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 75.6KB |
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雞新城疫病毒IgA抗體（NDV-IgA）ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗原一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被雞新城疫病毒的包被微孔中,，依次加入標本,、HRP標記的檢測抗原,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的
催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值）,，與CUT OFF值相比較,，從而判定標本中雞新城疫病毒IgA抗體（NDV-IgA）的存在與否。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管,，操作過程中避免任何細胞
刺激，收集血液后,，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地
分離,。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000 轉離心30 分鐘取上清,。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000 轉離心10 分鐘
取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于
-20℃,，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20 分鐘,。從冰箱取出的
濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結晶*溶解
后再使用。
2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。3. 預處理后的樣本請按照操作步驟用樣本稀釋液適當稀釋以達到
試劑盒的的*檢測效果。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間,、加液量及順序進行溫育操作,。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板12 孔×8 條12 孔×4 條無
陰性對照0.5mL 0.5mL 無
陽性對照0.5mL 0.5mL 無
檢測抗原-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進行稀釋
樣本稀釋液6mL 3mL 無
底物A 6mL 3mL 無
底物B 6mL 3mL 無
終止液6mL 3mL 無
封板膜2 張2 張無
說明書1 份1 份無
自封袋1 個1 個無
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋,，即1 份的20×洗滌緩
沖液加19 份的蒸餾水,。
雞新城疫病毒IgA抗體（NDV-IgA）ELISA試劑盒洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min 后甩盡
孔內液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次,。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5 次,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封
袋密封放回4℃。
2. 設置陰,、陽性對照孔和樣本孔,，陰、陽性對照孔中加入陰性對照,、
陽性對照各50μL,；
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；
4. 隨后陰,、陽性對照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）
標記的檢測抗原100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫
箱溫育60min,。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去
洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5 次（也可用洗板機洗板）,。6. 每孔加入底物A、B 各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL，15min 內,，在450nm 波長處測定各孔的
OD 值,。
結果判斷
1. 試驗有效性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00；
陰性對照孔OD 值平均值≤0.15,。
2. 臨界值（Cut off）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷：樣品OD 值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性
4. 陽性判斷：樣品OD 值＞臨界值（Cut off），樣品為陽性
試劑盒性能
1. 準確性：陽性對照孔OD 值平均值≥1.00,；陰性對照孔OD 值平均
值≤0.15,，說明試驗結果有效。
2. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應,。
3. 重復性：板內、板間變異系數(shù)均小于15%,。
4. 貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。
5. 雞新城疫病毒IgA抗體（NDV-IgA）ELISA試劑盒有效期：6 個月