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桔青霉探針法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒使用方法：
一,、樣品DNA的制備
用自選方法提取細(xì)菌樣品DNA,。注意：DNA純化方法是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA,，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測(cè)靈敏度,。
二、制備O157:H7標(biāo)準(zhǔn)曲線（以10-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽性對(duì)照，只提供沒有傳染性的,、可以直接使用的DN段作為陽性對(duì)照,。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6,，5,，4，3,，2和1號(hào),。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭,，下同）,。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對(duì)照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請(qǐng)不要將本試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍,，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）,。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照,。
5. 換槍頭，從6號(hào)管中取5 μL溶液到5號(hào)管中,，充分震蕩1分鐘,，得10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。
6. 換槍頭,，從5號(hào)管中取5 μL溶液到4號(hào)管中,，重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照,。
7. NC管中不加任何陽性對(duì)照。
8. 從1-6號(hào)管中分別取5 μL和待測(cè)樣品一起進(jìn)行定量PCR（見下步）,，每個(gè)樣品做3次重復(fù),。PCR后得到每個(gè)陽性對(duì)照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸,，以濃度的對(duì)數(shù)值為橫軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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