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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：小反芻獸疫病毒實時熒光PCR試劑盒

英文名稱：s Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，定性檢測病毒，對病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義,。

【檢驗原理】

本試劑盒針對病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，在反應體系中含病毒基因組模板的情況下,，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】小反芻獸疫病毒實時熒光PCR試劑盒

注：陰性對照為基因組DNA,，陽性對照為失去活性的病毒cDNA,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液,、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織,、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標本采集,，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml,，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢,。

(2) 腸內(nèi)容物：無菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中，立即送檢,。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,，置一1.5ml的潔凈離心管中，密閉送檢,。

3.應避免標本間交叉污染,。

4.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下,，避免反復凍融,。

【檢驗方法】小反芻獸疫病毒實時熒光PCR試劑盒

1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本準備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4. PCR（PCR擴增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序,。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增,。

小反芻獸疫病毒實時熒光PCR試劑盒

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【檢驗結(jié)果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 被檢樣本在采集、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的低檢出限為10² Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%,。

【注意事項】

1. 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服,、儀器、耗材應獨立使用,，不能混用,；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進行操作,；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理,。

3. 每次實驗應該設置陰,、陽性對照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心,。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在*次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放,。

6. 為防止熒光干擾,，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,。

7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置,；不同批號試劑不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None,。

9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。

小反芻獸疫病毒實時熒光PCR試劑盒