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尼氏單孢子蟲(chóng)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)
閱讀：486 發(fā)布時(shí)間：2019-8-9| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 82.3KB |
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尼氏單孢子蟲(chóng)PCR試劑盒
中英文名稱(chēng) | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 說(shuō)明書(shū) |
Haplosporidium nelsoni 尼氏單孢子蟲(chóng)PCR試劑盒 | 50次 | 1490元 |
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運(yùn)輸：低溫 保存：負(fù)20度 有效期：一年 貨期：2-3周 | |||
產(chǎn)品及特點(diǎn)
1. 即開(kāi)即用,，用戶(hù)只需要提供尼氏單孢子蟲(chóng)樣品,。
2. 根據(jù)尼氏單孢子蟲(chóng)保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物,，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng),。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。
4. 一管式熒光定量PCR檢測(cè),，避免后續(xù)污染,。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。
規(guī)格及成分
成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 試劑一 | 500μL（棕色管） |
熒光PCR模板稀釋液 | 試劑二 | 1 mL（黃蓋） |
尼氏單孢子蟲(chóng)PCR引物混合物 | 試劑三 | 100μL（白蓋） |
尼氏單孢子蟲(chóng)PCR陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 試劑四 | 50μL（紅蓋） |
使用手冊(cè) | 試劑五 | 1份 |
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存,，保存期限一年,。
自備試劑
DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定,，具體見(jiàn)使用方法）,。
使用方法
一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。
4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。
5. 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。
6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。
二,、樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品,，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）,，一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC,。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL,。
9. 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行）
10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照,。如果做2-3次重復(fù),，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | PCR陽(yáng)性 對(duì)照管（2-7管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
尼氏單孢子蟲(chóng)PCR 引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自備10×ROX (見(jiàn)注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得PCR陽(yáng)性對(duì)照 稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照,，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ,、MJ Option、MJ Chromo4,、MX3000,、MX4000、RotorGene 3000,、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX,，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
預(yù)變性 | 92℃ | 5分鐘 |
PCR反應(yīng) （30個(gè)循環(huán)） | 92℃ | 60 秒 |
54℃ | 60 秒 | |
72℃ | 60 秒 |
13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí),，大吸收光譜在471 nm,，結(jié)合DNA時(shí)的大吸收光譜在500 nm,，大發(fā)射光譜在530 nm,。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四,、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽(yáng)性。