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自然殺傷細(xì)胞和淋巴因子激活殺傷細(xì)胞的殺傷功能實(shí)驗(yàn)
閱讀：546 發(fā)布時(shí)間：2019-3-18| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 106.8KB |
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NK細(xì)胞存在于人或動(dòng)物外周血,、脾臟,、淋巴結(jié)和骨髓中,，能殺傷某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染靶細(xì)胞,，無需抗原或有絲分裂原刺激,，亦不依賴抗體或補(bǔ)體，在機(jī)體殺傷腫瘤,、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,。（來源：醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，主編金伯泉李恩善,，第1 版,，北京：世界圖書出版社，1990）
實(shí)驗(yàn)方法原理 NK細(xì)胞存在于人或動(dòng)物外周血,、脾臟,、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細(xì)胞,、病毒感染靶細(xì)胞,，無需抗原或有絲分裂原刺激，亦不依賴抗體或補(bǔ)體,，在機(jī)體殺傷腫瘤,、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
LAK是NK或T細(xì)胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下,，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細(xì)胞的功能,，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。
通過將同位素51Cr摻入到NK的靶細(xì)胞K562（紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞）或LAK的靶細(xì)胞LiBr（黑色素瘤細(xì)胞），按一定細(xì)胞比例與效應(yīng)細(xì)胞（NK或LAK）孵育4 小時(shí),，根據(jù)細(xì)胞上清中靶細(xì)胞被殺傷后所釋放的51Cr水平計(jì)算出殺傷細(xì)胞的殺傷活性,。
實(shí)驗(yàn)材料 K562LiBr
試劑、試劑盒 3H-TdR51CrFCSRPMI1640rHu IL-2
儀器,、耗材 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板CO2孵箱液閃儀計(jì)數(shù)儀
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、效應(yīng)細(xì)胞的制備
NK功能效應(yīng)細(xì)胞可取靜止的PBMC，或經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的PBMC,。
LAK功能的效應(yīng)細(xì)胞通常將PBMC或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）或體液（癌性胸腹水）中純化的淋巴細(xì)胞（1×106 /ml）在含有高劑量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 誘導(dǎo)2～5 天而成,。
二、殺傷試驗(yàn)
主要有4 h 51Cr釋放法和3H-TdR釋放法,，前者要求51Cr質(zhì)量好,，同位素半衰期較短，操作所需時(shí)間短,；后者需要無菌操作,，所需時(shí)間較長。
1. 51Cr 4 小時(shí)釋放試驗(yàn)
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562,，LiBr等）洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 /ml
（2）取1×106細(xì)胞（0.5 ml）,，加Na251CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h,，每15 min輕輕振搖一次
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次,，每次800 rpm，5 min
（4）重懸細(xì)胞濃度1×105 /ml
（5）96 孔V型或U型培養(yǎng)板中,，每孔加100 μl（1×104細(xì)胞）,，每份3 個(gè)復(fù)孔
（6）每孔加入100 μl不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞，大釋放組加入100 μl,，1 ％TritonX-100,；自然釋放組加100 μl*培養(yǎng)基
（7）200 g 離心1 min，37 ℃,、CO2孵箱 4 h,，200 g 離心1 min
（8）每孔取出100 μl上清，γ計(jì)數(shù)儀上測定cpm值
（9）計(jì)算
實(shí)驗(yàn)組cpm-自然釋放cpm
特異性殺傷率（％）＝─────────────
大釋放cpm-自然釋放cpm
2. 3H-TdR釋放試驗(yàn)
（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562,、LiBr等）洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 /ml,，加3H-TdR 20 μci
（2）37 ℃孵育2～3 h
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗滌3 次，每次800 rpm,，5 min 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105 /ml
（4）96 孔U型或平底培養(yǎng)板中,，每孔加100 μl（1×104細(xì)胞），每份3個(gè)復(fù)孔
（5）每孔加入100 μl不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞,，大釋放組加100 μl 1％TritonX-100,，自然釋放組加100 μl*培養(yǎng)基
（6）CO2孵箱培養(yǎng)18～24 h
（7）每孔吸出100 μl上清,，加入胰蛋白酶（終濃度0.15 ％）和DNA酶（終濃度為0.0125 ％）
（8）繼續(xù)孵育30 min
（9）用細(xì)胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上
（10）干燥后，移入液閃瓶中,，加入1 ml閃爍液，β液閃儀中測cpm值
（11）計(jì)算
實(shí)驗(yàn)組cpm
特異性釋放率（％）＝(1- ────── )×100％
對照組cpm
收起
注意事項(xiàng)
1. 每次試驗(yàn)取3～4 個(gè)不同效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例,，常用效靶比例為100∶1,，50∶1，25∶1,，12.5∶1,。
2. 誘導(dǎo)LAK細(xì)胞過程中要注意無菌操作。
3. 避免同位素污染,。
4. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,，可采用純化的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用Percoll不連續(xù)密度梯度離心純化NK細(xì)胞,。
（1）1個(gè)溶解單位（Lytic unit,，LU）為一定效應(yīng)細(xì)胞30 ％溶解（殺傷）5×103靶細(xì)胞（K562）的水平。
（2）如需進(jìn)一步純化LGL,，可通過除去具有高親和性羊紅細(xì)胞受體細(xì)胞（T細(xì)胞）,，因?yàn)镹K細(xì)胞只具有低親和性的綿羊紅細(xì)胞受體（ER）。具體方法是將Percoll分離的位于第2梯度的細(xì)胞洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106 /ml,，移入試管,，加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC，100 g離心5 min,，29 ℃孵育1 h,，輕輕重懸細(xì)胞，疊加于3 ml Ficoll上,，400 g室溫下離心30 min界面不形成花環(huán)的細(xì)胞即為LGL,，純度可>90％。
（3）在用PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行NK活性測定時(shí),，如想除去PBMC懸液中混雜的紅細(xì)胞,，可用蒸餾水低滲的方法除去紅細(xì)胞，而不用NH4Cl方法,，因?yàn)楹笳呖山档蚇K功能,。
（4）在小鼠NK實(shí)驗(yàn)中必須注意小鼠的品系和周齡，不同小鼠系NK活性有明顯的差別
（5）3周以內(nèi)或超過3個(gè)月以上小鼠的NK水平一般很低,。