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小鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗
閱讀：323 發(fā)布時間：2019-2-14實驗方法原理
將小鼠的肝細(xì)胞從機(jī)體中取出,，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理,，分散成單細(xì)胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存,、生長和繁殖,。
實驗材料小鼠
試劑、試劑盒DMEM無血清DMEM培養(yǎng)基胰酶PBS
儀器,、耗材飯盒紗布剪子鑷子燒杯平皿研磨玻片濾網(wǎng)離心管6孔培養(yǎng)板吸管移液管手套微量加樣器
實驗步驟
1. 將小鼠斷頸致死,，置75%酒精泡2-3秒鐘,，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中,。
2. 剔除脂肪,、結(jié)締組織、血液等雜物,，轉(zhuǎn)移到另一個盛有PBS液的平皿中,。
3. 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊（大小約1mm2），玻片研磨,，轉(zhuǎn)到離心管,，離心（1 000 rpm，5 min）,。
4. 視組織或細(xì)胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶,，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次,，或用吸管吹打一次,，使細(xì)胞分離。
5. 加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用,。
6. 用100目孔徑濾網(wǎng)濾過,，除去未消化的大組織塊。
7. 再次離心5 min,，棄上清液,。
8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml，沖散細(xì)胞,，再離心一次,，棄上清液。
9. 加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml（視細(xì)胞量）,，血球計數(shù)板計數(shù),。
10. 將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中,，37℃下培養(yǎng),。
收起
注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件,。細(xì)胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行,。
2. 在超凈臺中，組織細(xì)胞,、培養(yǎng)液等不能暴露過久,，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟,，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住,，以防止細(xì)菌落入,。
4. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手,。試劑瓶口也要擦拭,。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行,，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火,，且冷卻后才能夾取組織,。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜,。
6. 操作動作要準(zhǔn)確敏捷,，但又不能太快，以防空氣流動,，增加污染機(jī)會,。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理,。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位,。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。