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大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：342 發(fā)布時(shí)間：2019-2-14| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 110.9KB |
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實(shí)驗(yàn)方法原理
水合氯醛腹腔麻醉,，采用膠原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度離心的方法分離,、純化大鼠胰島,，并分離、培養(yǎng)胰島單細(xì)胞,。
實(shí)驗(yàn)材料一周齡Wistar 大鼠
試劑,、試劑盒D-Hanks’液胰蛋白酶Ⅴ型膠原酶葡萄糖碘乙酸
儀器、耗材手術(shù)剪手術(shù)鉗眼科剪刀眼科鑷子大頭針手術(shù)刀片培養(yǎng)皿
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 一周齡Wistar大鼠,，斷頸處死,，于75%乙醇浸泡15 分鐘，無菌取出胰腺,，于冰冷無菌D-Hanks’液中漂洗,，用眼科剪仔細(xì)清除脂肪、包膜,、血管等胰外組織,，轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中。
2. 加入少量無菌D-Hanks’液,，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片,，用滴管輕輕吸出上層細(xì)小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks’液反復(fù)清洗 8——10 次,，加入10 倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液： 0.05 g 胰蛋白酶,，0.025 g Ⅴ型膠原酶（663 U/mg），0.05g葡萄糖,，溶于100ml無 Ca2+,、Mg2+的0.01 mol/L PBS（pH 值為 7.4）溶液，用0.22 µm 微孔濾膜濾菌],，38℃±1℃消化,，消化過程中不斷震蕩，10 分鐘后棄去上清液,。
3. 用無菌D-Hanks’液將組織塊清洗 2——3 次,，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復(fù)上述步驟,，此時(shí)組織塊邊緣模糊,。
4. 將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分鐘，將消化酶液與組織塊分開,，組織塊重新加入新鮮消化酶液進(jìn)行消化,；而原消化酶液1500 rpm離心 10 分鐘，取沉淀即為消化下的細(xì)胞,，重新用無菌D-Hanks’懸浮,，離心，重復(fù) 1——2 次,，再用培養(yǎng)基洗 2——3 次,，用培養(yǎng)基懸浮即得細(xì)胞懸液。
5. 將消化過的組織塊重復(fù)消化5——6 次至組織塊消化*,，重復(fù)以上操作,。
6. 合并幾次所得細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105個(gè)細(xì)胞/mL,，將細(xì)胞懸液接種于24 孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1 ml,，置于37℃,，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。
7. 由于成纖維細(xì)胞貼壁要比胰島細(xì)胞迅速,，接種15 h 后，輕輕振蕩培養(yǎng)板,，將上面未貼壁的細(xì)胞接入新的培養(yǎng)板中,，可除去部分成纖維細(xì)胞,。
8. 將新培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時(shí)后,，換新鮮配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，可除去絕大部分成纖維細(xì)胞,，而胰島細(xì)胞不受傷害,，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在 37℃,、5% CO2,，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換培養(yǎng)液,，獲得單層胰島細(xì)胞,。
收起
注意事項(xiàng)
1. 大鼠的胰島提取一般胰尾含有量較多，一般提取時(shí)要注意以為部分,，充盈良好與否很關(guān)鍵,，對(duì)于提取量至關(guān)重要。
2. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請(qǐng)注意保持無菌操作,。
3. 傳代培養(yǎng)過程中,，胰酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài),。
4. 培養(yǎng)基基于4℃條件下可保存3——6個(gè)月,。