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大鼠乳鼠成骨細胞培養(yǎng)實驗
閱讀：557 發(fā)布時間：2019-2-13實驗方法原理
取材于出生2~3 d 小鼠顱骨，以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng),，采用膠原酶消化法分離成骨細胞,，并進行細胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細胞是一種可靠,、簡便,、快速的細胞原代分離培養(yǎng)方法。
實驗材料SD大鼠
試劑,、試劑盒F12 *培養(yǎng)液胰蛋白酶Ⅱ型膠原酶酒精
儀器,、耗材手術器械磁力攪拌器
實驗步驟
一、實驗步驟
1. 拉頸處死24 小時內新生的SD大鼠,，75%乙醇浸泡5 min,，取出頭蓋骨，分離頂骨和額骨,，冰生理鹽水液反復洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標本除去脂肪組織及殘留血,，放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌， 將顱骨剪成2～5 mm2 碎片,，將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預消化15 min,，以清除纖維組織細胞，棄去上清液(其中主要含成纖維細胞)。
2. 然后以0.1% Ⅱ型膠原酶10 ml,，在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,，室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘,，收集消化液,，室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,，用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細胞,，接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中，補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達到12 ml,；對靜置后沉淀部分可再重復以膠原酶消化20 分鐘,、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,，將獲得的3 瓶細胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,，在5% CO2，95%空氣,，37℃溫度下培養(yǎng),，24 小時后可見細胞貼壁生長，胞質開始伸展,，換新鮮培養(yǎng)液,，以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注：消化視具體情況而定，也可多消化 1 遍),。
3. 原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿,。傳代時，取生長良好,、貼壁松緊適度的成骨細胞 1 瓶,，棄去培養(yǎng) 液，傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍,，加 0.25%胰酶1 ml,，室溫下消化3～5 分鐘，將胰蛋白酶液棄去,，加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘,。將已消化的細胞收集、合并,，計數(shù),；用 F12 *培基調節(jié)至細胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細胞進行實驗,。代數(shù)太多,，細胞老化或者分化明顯,。
二、結果
如圖所示,，成骨細胞的形狀和成纖維細胞非常相似,，但是不同的是，比成纖維細胞更不容易消化,，尤 其是傳代次數(shù)多,，細胞老化的時候，非常難消化,，并且不易消化成單個細胞,。
圖1：成骨細胞
圖2：成骨細胞100倍
圖3：成骨細胞形成的礦化結節(jié)
三、鑒定的方法
1. 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測
2. 骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測
3. 礦化結節(jié)檢測
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注意事項
1. 自取材開始,，保持所有組織細胞處于無菌條件,。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2. 在超凈臺中,，組織細胞,、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā),。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟,，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住,，以防止細菌落入,。
4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手,。試劑瓶口也要擦拭,。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行,，耐熱物品要經常在火焰上燒灼,。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火,，且冷卻后才能夾取組織,。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜,。
6. 操作動作要準確敏捷,，但又不能太快，以防空氣流動,，增加污染機會,。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理,。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位,。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
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其他
一、討論
成骨細胞包繞在硬組織中,，致使處理困難,，可采用骨組織塊法、酶消化法,、骨膜組織塊法,、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經 EDTA 處理并經膠原酶消化，均可培養(yǎng)出成骨細胞,。體外培養(yǎng)的成骨細胞保持 有骨組織細胞的某些特征,。據(jù)文獻報道，不同方法培養(yǎng)的成骨細胞形態(tài)是不同的[1],。
二,、文獻
[1] 司徒鎮(zhèn)強. 細胞培養(yǎng) [M]. 版. 西安. 世界圖書出版社西安公司, 2000:115.