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實(shí)驗(yàn)步驟    
基本方案 1 NK T 細(xì)胞的鑒定

材 料

外周肝素抗凝血

P B S

R P M I -1640 培養(yǎng)基,，含 1 0 % (V /V ) 人血清或 F C S 以 及 10U /m l I L -2 (可選）

流 式 細(xì) 胞 緩 沖 液（flow cytometry buffer,， FCbuffer) : 含 1 % (v/V ) 人 血 清 ,、1 % (V / V ) FBS 和 0. 1 % (m /V ) 疊氮鈉的 PBS

熒光素標(biāo)記的抗 V a 24 單 抗（cloneC15B 2 ， P E 或 FITC 標(biāo) 記 ,， Coulter-Immunotech)

熒光素標(biāo)記的抗 V p i l 單 抗（clone C 21D 2, P E 或 F I T C 標(biāo) 記 ,， Coulter)

突光素標(biāo)記的同型對(duì)照抗體（BDPharmingen)

突光素標(biāo)記的抗 6B 1 1 單 抗（B D Pharmingen; 可選）

Cy5 標(biāo)記的抗 C D 4 單抗、 Cy5 標(biāo)記的抗 C D 8 單 抗
（BDPhanningen,，可選）

熒光素標(biāo)記的抗 C D 161 單 抗（Coulter,，推薦使用）

熒光素標(biāo)記的其他相關(guān)抗體（可選）

含 4 % 甲醛的 PBS (P B S w ith 4 % paraformaldehyde， P F A ) : 配制時(shí)置通風(fēng)櫥中,，加熱 至 80°C ,， 可攪拌以加速溶解，冷后分裝,，一 20°C 保存

0.5m l 微量離心管或 9 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板

流式細(xì)胞儀

1 . 準(zhǔn)備人外周肝素抗凝血（5?10 ml) ,，根據(jù)情況,，室 溫 可 保 存 I d 。 Ficoll-Hypaque 密

基 本 方 案 2 免 疫 磁 珠 法分 離 NK T 細(xì)胞及后續(xù)擴(kuò)增

本法可從幾毫升的外周血中分離和擴(kuò)增 N K T 細(xì) 胞（< 1 0 000 N K T 細(xì)胞）,，濃縮白 細(xì) 胞（分離血小板時(shí)的副產(chǎn)品）也可作為 N K T 細(xì)胞的來(lái)源,。

材 料（帶 V 項(xiàng) 目 見(jiàn) 附 錄 1)

外周肝素抗凝血

P B S ，含 2m m o l / L E D T A (附錄 1)

未標(biāo)記的抗 V 〇 t 2 4 單 抗（Coulter)

未標(biāo)記的抗 6B 1 1 單 抗 ,，即 抗 TCRot 單 抗（B D Pharmingen)

備 選 方 案 I N K T 細(xì)胞的流式分選及擴(kuò)增

附 加 材 料

備 選 方 案 2 NK T 細(xì)胞的克隆

附 加 材 料（其 他 材料見(jiàn)基本方案 1 和 2) 1

T 細(xì)胞克隆培養(yǎng)基： R P M I -1640,，含 1 0 % (W V ) 自體人血清、 20U /m l I L -2 及20U/ml IL-7植物血凝素 (phytohemagglutinin-P ,， P H A -P ; Difco)

1.Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離 T O M C (單 元 8.1),。取出部分細(xì)胞，照射滅活后用作飼養(yǎng)細(xì)胞,。

2 . 剩余細(xì)胞用 P B S 洗滌一遍,，加 入 含 1 0 % 人血清的 P B S 重懸細(xì)胞，調(diào) 整 濃 度 為 IO8個(gè)細(xì)胞/m l ,，冰 浴 15 min,。

3 . 加入熒光素標(biāo)記的抗 V a 2 4 單抗和另一種熒光素標(biāo)記的抗 V p i l 單 抗（或標(biāo)記的抗6B 11 單抗，推薦使用）,，終濃度均為 IOiU g A n U 冰 浴 30 min,。同時(shí)，取部分細(xì)胞加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體,。

4 . 在 9 6 孔 圓 底 培 養(yǎng) 板 中 加 入 IO5 照 射 滅 活 后（5000rad) 的 自 體 飼 養(yǎng) 細(xì) 胞 和 P H A - P(終 濃 度 2ug/ml) ,，補(bǔ) 充 T 細(xì)胞克隆培養(yǎng)基至終體積 0.1m l 。同時(shí)用流式分選儀分選V a24+ Vpll+ (或 6B 1 1 + ) 雙陽(yáng)性細(xì)胞,，分選出的細(xì)胞應(yīng)直接加入上述 9 6 孔板中,。

5.—周后，每孔加入 0.1 ml T 細(xì) 胞 克 隆 培 養(yǎng) 基（不 含 P H A -P ),。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況： 10?M d 后 ,，陽(yáng)性孔中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)母細(xì)胞克隆（母細(xì)胞 圓 形 ,，體積較大,，每個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)超過(guò) 100 個(gè)）。

6 . 根據(jù)克隆生長(zhǎng)情況,，每 隔 2?3d 用 T 細(xì)胞克隆培養(yǎng)基傳代。如果用自體血清進(jìn)行 T克隆,，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增后,，每次傳代時(shí)培養(yǎng)基中增加 2 5 % 的異體人血清或 F B S ，直至*取代自體血清,。

7 . 當(dāng)細(xì)胞數(shù)量足夠時(shí),，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同克隆的 V a 2 4 和 Vpll ( 或 6B 1 1 ) 表達(dá)情況,。

3 ?4 周 后 ，細(xì) 胞 可 進(jìn) 行 二 次 刺 激 ,，或 者 在 T 細(xì) 胞 克 隆 培 養(yǎng) 基 中 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 幾 周 ,。

輔 助 方 案 NK T 細(xì)胞的二次刺激和克隆

材 料

4.第 1 天 ，加入重組 IL-2 及 IL-7 各 50U /m l ,。

5 . 第 5 天 ,，用新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行半量換液，維持各細(xì)胞因子濃度為 50U /m l ,。

6 . 第 1 0 天 ,，在顯微鏡下觀察 T 細(xì)胞克隆擴(kuò)增情況。如果母細(xì)胞密度較高且培養(yǎng)基顏色變黃,，用含細(xì)胞因子的擴(kuò)增培養(yǎng)基將細(xì)胞進(jìn)行 1 : 2 傳代,。對(duì)于生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，可每 隔 2?3d 進(jìn)行細(xì)胞傳代,。

經(jīng) 過(guò) 2 周左右時(shí)間細(xì)胞可擴(kuò)增約 1000 倍 ,。在無(wú)追加刺激的情況下，細(xì)胞可繼續(xù)培養(yǎng)幾周,。