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實驗方法原理    
從豚鼠胰腺組織分離細(xì)胞，用紗布或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,，將過濾的細(xì)胞懸液輕輕加于 BSA 液上面,。通過 3 次連續(xù)離心和混懸細(xì)胞，使呈團狀的細(xì)胞分散,。然后,，將細(xì)胞接種于涂有膠原蛋白的培養(yǎng)器皿。
試劑,、試劑盒    F12K 組織培養(yǎng)液含有 20% 小牛血清HBSSHBSS-DVC葡萄糖胰蛋白酶液胰蛋白酶液枸櫞酸緩沖液凡枸櫞酸三鈉鹽NaCl葡萄糖酚紅膠原蛋白酶液溶解膠原蛋白酶 硅化錐形瓶吸管
儀器,、耗材    Blichner 漏斗透析管Sidearm 瓶聚丙烯離心管紗布 培養(yǎng)皿
實驗步驟    
材料

1. 無菌 

（1）F12K 組織培養(yǎng)液：含有 20% 小牛血清（F12K-CS20)

?（2）HBSS

（3）HBSS-DVC: 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS

（4）葡萄糖（Difco,0155-174,BDBiosciences)

（5）胰蛋白酶液：用枸櫞酸緩沖液配制 0.25% 胰蛋白酶液（1:250, Difco, BDBi-osciences)。 枸櫞酸緩沖液（pH7.6) 含有 3 g 凡枸櫞酸三鈉鹽,、6 g/L NaCl ,、5 g/L 葡萄糖和 0.02 g/L 酚紅。

（6）膠原蛋白酶液：1800U/ml,，用 1XHBSS-DVC (pH 7.2) 溶解膠原蛋白酶 (GIBCO),。調(diào)整膠原蛋白酶液的 pH 至 7.2,，在 4℃ 條件下用 12Kda 透析膜透析 4 h,，透析液為含有 0.2% 葡萄糖的 HBSS-DVC。除去 HBSS 后,，用 HBSS-DVC 重復(fù)此步驟 16～18 h ,。過濾除菌，分裝成 10～20 ml,，在 70℃ 以下的條件下儲存,。

（7）25 ml 硅化錐形瓶（Bellco)

（8）吸管：5 或 10 ml, 大口徑（Bellco)

（9）Blichner 漏斗 

（10）透析管（SpectroPor)

（11）Sidearm 瓶:250 ml

（12）聚丙烯離心管：50 ml

（13）紗布 

（14）涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿（Biocoat，BD Biosciences)

2. 非滅菌 

（1）水浴振蕩器（M5B 型,，11-22-1,，Backer)
（2）離心機

操作步驟

1. 配制膠蛋白原酶和胰蛋白酶（1:2) 混合消化液，加熱至 37°C ,。

2. 在無菌條件下取出整個胰腺（0.5～1 g ),，放人 F12K -CS20 中。

3. 剪除腸系膜和其他組織,，將胰腺切成 1～3 mm 小塊,。

4. 將組織塊移人盛有 5 ml 預(yù)熱的混合消化液的 25 ml 硅化錐形瓶，在 37℃ 條件下用水浴振蕩器振蕩消化（120r/min ,15 min ),。加人新鮮消化液,，重復(fù)此步驟 2～3 次,，直至大部分組織被消化分散。

5. 每次振蕩消化后,，使大的組織塊沉下,，然后將上清液移入 50 ml 聚丙烯離心管。離心管盛有約 12 ml 冷 F12K-CS20 , 以中和消化液,。

6. 離心（600r/min,，5 min ) 后，用 5～10 ml 冷 F12K -CS20 混懸細(xì)胞,，將離心管放在冰上,。

7. 收集細(xì)胞懸液，經(jīng)數(shù)層滅菌紗布（放人 Blichner 漏斗內(nèi)）過濾,。在過濾過程中,，將漏斗柄插入真空瓶，輕輕吸細(xì)胞懸液,。取少量細(xì)胞懸液,，做定量分析。

8. 通常情況下,，每毫克組織獲得 1X105～2X105 個細(xì)胞,，90%～95% 細(xì)胞為活細(xì)胞。

9. 將 5X107～5X108 個 細(xì)胞加到 2～4 個 50 ml 聚丙烯離心管的液柱表面,，每個離心管內(nèi)盛有 35 ml 添加 4% 冷 BSA 的 HBSS-DVC(pH 7.2),。然后，離心 (600r/min,，5 min ),。此步驟對于有效地將胰腺的腺泡細(xì)胞與胰島細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分離是至關(guān)重要的,。吸取上清液,，重復(fù)此分離步驟 2 次，每次分離后收集細(xì)胞,，用冷 F12K-CS20 混懸細(xì)胞,。

10. 用 5～10 ml 冷 F12K-CS20 收集細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液,，計數(shù)細(xì)胞,。每毫克組織獲得 2X 104～5X104 個細(xì)胞，80%～95% 細(xì)胞為腺泡細(xì)胞,。接種密度為 3X105 個細(xì)胞/cm2,。在 72 h 內(nèi)，細(xì)胞貼壁，形成克隆,。