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雞胚成纖維細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)
閱讀：544 發(fā)布時(shí)間：2019-1-10| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.4KB |
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實(shí)驗(yàn)方法原理
用雞胚制備培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞,。
實(shí)驗(yàn)材料 9 日齡雞胚
試劑,、試劑盒 70% 乙醇胰酶／EDTA無添加 MEM 培養(yǎng)基* MEM-10 培養(yǎng)基
儀器、耗材 無菌解剖剪無菌鑷子100 cm2 無菌培養(yǎng)皿10 ml 注射器無菌胰酶消化瓶（帶磁力攪拌棒）CO2 培養(yǎng)箱500 ml 燒杯紗布 Sorvall 離心機(jī)250 ml 離心管150 cm2 組織培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將 10 只 9 日齡雞胚有空氣部分朝上放置,，噴上 70% 乙醇,。
2. 用無菌的解剖剪將雞蛋的頂部打開，剪掉膜上蛋殼,，使膜保持完整,。用無菌鑷子將膜取掉。其他雞蛋亦重復(fù)相同操作,。
3. 取出雞胚,，放入無菌的 100 cm2 培養(yǎng)皿。
4. 剪掉每個(gè)雞胚的頭和足,，將剩余的身體放入無菌的 100 cm2 平皿中,，加入 10 ml 無添加劑的 MEM 培養(yǎng)基。通過 10 ml 注射器（5 個(gè)雞胚/注射器）擠壓,，將雞胚切碎并打人無菌的胰酶消化瓶中,。
5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA，并在加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37℃ 持續(xù)攪拌溫育 5 min,。
6. 將液體從無菌胰酶消化瓶中倒人杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯,，將過濾后的液體轉(zhuǎn)移至 250 ml 離心瓶中。
7. 向含有剩余組織的無菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鮮的胰酶/EDTA,，37℃ 溫育,。
8. 將消化液倒入另一個(gè)杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯，并將過濾后的液體加入先前的 250 ml 離心瓶中,。
9. 在 Sorvall RC-3B 離心機(jī)中,，4℃，1200 g 離心 10 min,。
10. 丟棄上清,，加入 10 ml MEM-10 *培養(yǎng)基,，反復(fù)抽吸 10～15 次重懸沉淀，并將體積調(diào)整至 100 ml,。
11. 將懸液轉(zhuǎn)移至 250 ml 離心瓶中,，4℃，1200 g 離心 10 min,。
12. 用 5 ml MEM-10 *培養(yǎng)基重懸沉淀,，并將體積調(diào)整至 30 ml。
13. 將細(xì)胞懸液按每瓶 1 ml 加入到 30 個(gè)含有 30 ml MEM-10 *培養(yǎng)基的 150 cm2 組織培養(yǎng)瓶中,。
14. 37℃ 培養(yǎng)幾天直至細(xì)胞長(zhǎng)滿,，然后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 31℃ 保存。
CEF 細(xì)胞培養(yǎng)液能夠在 31℃ 保存 2～3 個(gè)星期,。原代的 CEF 細(xì)胞也能直接用于病毒生長(zhǎng),，或?qū)⒁让柑幚砗蟮?CEF 細(xì)胞凍存在液氮中留以后使用。