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懸浮細胞的免疫熒光標記實驗
閱讀：482 發(fā)布時間：2019-1-3| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 17.5KB |
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| 資料類型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 482次 |
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實驗方法原理 免疫熒光標記技術(shù)（immunofluorescence technique）是將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素,，當與其相對應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)時，在形成的復(fù)合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見發(fā)出熒光的抗原抗體結(jié)合部位，檢測出抗原或抗體。
實驗材料 懸浮細胞
試劑,、試劑盒 多聚-L-賴氨酸
儀器、耗材 離心機培養(yǎng)箱
實驗步驟
1. 細胞在冰浴中冷卻,，然后用臺式離心機于4℃以800 g 離心5 min,，吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細胞。
2. 離心吸去PBS,，以1~2 ml 2%PFA固定液,，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細胞，置冰上固定30 min,。
3. 離心,、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細胞,，放5 min 后,，用PBS再次洗滌細胞。
4. 稀釋的抗體于4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min,，250 μl 抗體足夠用于5×106細胞,。
5. 離心細胞，吸去PBS,，重懸細胞于抗體中,，置4℃溫育1 h。
6. 用4℃ PBS稀釋細胞和抗體至15 ml,。
7. 離心,，吸去PBS，以4℃ PBS重懸細胞,，重復(fù)1次,。
8. 第二抗體4℃用微量離心機以13 500 g 離心2 min，5×106細胞用250 μl 抗體足夠,。
9. 吸去PBS,，以第二抗體重懸細胞，4℃溫育1 h,，重復(fù)步驟6及步驟7,。
10. 除非立即觀察細胞，否則在進行細胞濃縮的下一步操作之前應(yīng)以鋁萡包裹離心管并冷藏。
11. 離心細胞并以少量PBS重懸（勿用水）,，將細胞懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層的載玻片上,，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結(jié)果,。
收起
注意事項
1,、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時間過長，可能會使熒光提前衰退,。
2,、每次試驗均需設(shè)置以下三種對照：
(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記物;
(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記物;
(3) 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物。