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傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：499 發(fā)布時(shí)間：2018-12-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 662.8KB |
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傳代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)方法原理
當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后,，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂,，一方面細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止,；另一方面培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于細(xì)胞生長(zhǎng)甚至發(fā)生中毒,，如果不及時(shí)的減少細(xì)胞密度，細(xì)胞將逐漸衰老死亡,。因此需要將培養(yǎng)物按照比例重新接種到新的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),。這個(gè)過程就稱為傳代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代,，而懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代則用直接傳代法或離心法傳代,。細(xì)胞種類不同，所需的培養(yǎng)基,、添加劑以及傳代培養(yǎng)的操作都會(huì)有所不同,，
實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞
試劑、試劑盒 Hanks胰蛋白酶EDTA培養(yǎng)液
儀器,、耗材 吸管培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、貼壁細(xì)胞：HeLa細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
1. 選取生長(zhǎng)密度80%左右的HeLa細(xì)胞，在生物安全柜中操作,，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基,，加入2 mL的D-Hanks溶液，漂洗細(xì)胞以除去殘留的血清,。
2. 吸去培養(yǎng)皿中的D-Hanks溶液,，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化2～3 min(如消化程度不夠,，可延長(zhǎng)時(shí)間),，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓時(shí),，輕輕吸去酶消化液（如果有較多細(xì)胞漂起,，需要直接加入*培養(yǎng)基來(lái)終止胰蛋白酶的消化反應(yīng)）。
3. 加入4 mL*培養(yǎng)基,，用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞成為細(xì)胞懸液,。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。
4. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,。
5. 接種好的細(xì)胞，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱,、本次傳代日期和操作人,，輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。
6. 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)密度進(jìn)行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）,。
二、懸浮細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
懸浮細(xì)胞不貼壁（半貼壁細(xì)胞貼壁不緊）,，所以不需要借助胰蛋白酶消化,，具體過程如下：
1. 取狀態(tài)良好的細(xì)胞，在生物安全柜中操作,，用移液管把細(xì)胞吹打均勻,。
2. 把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min,。
3. 輕輕吸去上清后用*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。
4. 接種好的細(xì)胞,，應(yīng)在培養(yǎng)皿上標(biāo)記上細(xì)胞名稱,、本次傳代日期和操作人．輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移到CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)。
5. 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長(zhǎng)密度進(jìn)行相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理）,。
收起
注意事項(xiàng)
1. 把握發(fā)了傳代時(shí)機(jī)，已如前述,，在80%~90%匯合階段,，過早傳代細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳,。
2. 消化時(shí)間要適度,，過短細(xì)胞不易從瓶壁脫落,，過長(zhǎng)細(xì)胞可脫落流失,。
3. 消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈,，細(xì)胞反應(yīng)快,，所需消化時(shí)間短，掌握不好,，細(xì)胞易流失,。
4. 各種細(xì)胞對(duì)消化反應(yīng)不同，有的敏感，有的遲鈍,，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜消化措施,。有的細(xì)胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來(lái),，但這樣容易傷害細(xì)胞,，細(xì)胞大片脫落掉，不易計(jì)數(shù),，應(yīng)盡可能采用消化法分散細(xì)胞為妥,。
5. 消化傳代良好時(shí)，細(xì)胞受損害少,，細(xì)胞懸液均勻,，各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度一致,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性大,。