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小腦顆粒神經(jīng)元的原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：254 發(fā)布時(shí)間：2018-12-14| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.4KB |
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實(shí)驗(yàn)方法原理 小腦顆粒神經(jīng)元的體外培養(yǎng)受取材部位、特殊培養(yǎng)條件等因素的影響，易于獲得純度較高的培養(yǎng)物。該細(xì)胞為雙極突起,，常用來研究神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。其培養(yǎng)條件具有高濃度鉀離子依賴特性,，常用來作為誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的研究模型,。當(dāng)成熟顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)液由高KCl(通常是25-30mmol/L)換為低KC!(基本培養(yǎng)液中已含5mmol/L KCl)時(shí)，細(xì)胞會(huì)逐漸發(fā)生凋亡,。
實(shí)驗(yàn)材料 新生7d的SD大鼠仔鼠
試劑、試劑盒 10%胎牛血清+DMEMNeurobasal+B27KCl
儀器,、耗材 培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
原代培養(yǎng)來自于新生7d的SD大鼠小腦顆粒神經(jīng)元,，可參考Moreno-Flores的方法，此方法培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元純度達(dá)到95%以上,。具體操作過程如下,。
1.首先依照總論的方法獲得細(xì)胞懸液，然后在離心獲得的細(xì)胞沉淀中,，加入少量的*培養(yǎng)液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重懸細(xì)胞,，再根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果補(bǔ)加適的*培養(yǎng)液。根據(jù)培養(yǎng)目的按照合適的密度接種細(xì)胞于多聚賴氨酸包被的介質(zhì)上,，37℃,5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng),。
2.細(xì)胞培養(yǎng)第4天1/2量換液，至第7天細(xì)胞基本成熟,。小腦顆粒神經(jīng)元胞體小,，接種后約24h,開始伸出突起，突起易成束生長(zhǎng),。圖I-2示接種48h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況,。
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注意事項(xiàng)
1.在原代取材時(shí),，由于取材部位和仔鼠體積的原因，通常將消過毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中,，直接用解剖器械取出完整的小腦,，不做斷頭處理。
2.小腦的腦膜不易剝離干凈,，要特別仔細(xì)去除,，否則培養(yǎng)物中成纖維細(xì)胞的污染難以去除。
3.由于培養(yǎng)細(xì)胞的目的不同,，接種時(shí)的密度就有區(qū)別,。如用于神經(jīng)突起觀察，可接種(1-3)x105/cm2的密度,；如用于凋亡誘導(dǎo)的研究,，可接種(4-6)x105/cm2的密度。
4.在做凋亡誘導(dǎo)時(shí),，通常將含高鉀的培養(yǎng)液全量換液為不含額外添加KCl的普通Neurobasal+B27培養(yǎng)液即可,。按照核固縮判斷的方法，8h后凋亡的細(xì)胞數(shù)量可達(dá)40%左右,。
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其他
1小腦顆粒神經(jīng)元胞體小,，突起細(xì)長(zhǎng)，且容易成束生長(zhǎng),，個(gè)人感覺該細(xì)胞可做突起生長(zhǎng)的大致觀察,，并不適合利用軟件分析突起長(zhǎng)短。神經(jīng)元一般3-4d突起就可長(zhǎng)好,，可開始觀察,。
2.在體外培養(yǎng)7d左右待細(xì)胞成熟后，可以開展凋亡實(shí)驗(yàn),。如添加保護(hù)劑抑制凋亡,，應(yīng)注意誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間不可過長(zhǎng)，否則可能導(dǎo)致保護(hù)實(shí)驗(yàn)失敗,。