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培養(yǎng)操作及注意事項(xiàng)說(shuō)明

一．產(chǎn)品簡(jiǎn)介

1,、細(xì)胞名稱(chēng)：A549,；人肺癌細(xì)胞

2、生長(zhǎng)特性：    □ 貼壁   □ 懸浮   □半懸浮半貼壁

3,、細(xì)胞生長(zhǎng)條件：

4,、背景資料：該細(xì)胞系是1972年由GiardDJ通過(guò)肺癌組織移植培養(yǎng)建系的,，源自一位58歲的白人男性。A549能通過(guò)胞苷二磷脂酰膽堿途徑合成富含不飽和脂肪酸的卵磷脂,；角蛋白陽(yáng)性,。

二．使用方法

1、您收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作：

取出25cm²培養(yǎng)瓶,，75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，拆下封口膜,，放入37℃,，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代,。

2,、細(xì)胞傳代：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀(guān)察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心5min,；

3）棄上清，沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸,，然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,，后放入37℃，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4）待細(xì)胞*貼壁后,，觀(guān)察培養(yǎng)結(jié)果，之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代,。

3,、細(xì)胞凍存：

1）細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm²培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,，倒置顯微鏡下觀(guān)察,，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,，1000rpm離心5min,；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中,；

4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,，然后將其移入-80℃過(guò)夜，24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存,。使用程序降溫盒可直接放入-80℃,。 

4、細(xì)胞復(fù)蘇：
1）從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具）,，快速將其置入37℃水浴中解凍,，直至凍存管中無(wú)結(jié)晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁,；
2）將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中,， 1000rpm離心5min；

3）棄上清,，沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸,，接種25cm²培養(yǎng)瓶，于37℃,，5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4）第二天，換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。