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轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立（SOP）
閱讀：1419 發(fā)布時(shí)間：2018-9-13| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 22KB |
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名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立(SOP)
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因小鼠
目的：在動(dòng)物體研究轉(zhuǎn)化基因
原理：
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指染色體基因組中整合有外源基因并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物,。整合到動(dòng)物染色體基因組的外源基因稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因,。轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是指制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所需的一套技術(shù),，它涉及外源基因的構(gòu)建,、載體和受體的篩選,、基因?qū)思夹g(shù),、供轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物等許多方面。
當(dāng)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí),，外源基因可能只整合到動(dòng)物的部分組織細(xì)胞的基因組,，也可能整合進(jìn)動(dòng)物所有組織細(xì)胞的基因組中。部分組織細(xì)胞的基因組中整合有外源基因的動(dòng)物,，稱(chēng)為嵌合體動(dòng)物。此類(lèi)動(dòng)物中,，只有外源基因整合的“部分組織細(xì)胞”恰為生殖細(xì)胞時(shí),，轉(zhuǎn)基因才具有遺傳性狀,，否則，外源基因?qū)⒉荒軅鹘o子代,。
轉(zhuǎn)基因的方法多樣，有胚胎干細(xì)胞法,、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法,，顯微注射法等，此章介紹顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠,。此法獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的數(shù)量較多,。
（一）顯微注射法的基本原理和方法
轉(zhuǎn)基因小鼠制備的基本原理是將改建后的目的基因(或基因組片段)用顯微注射法注入供體小鼠的受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)，然后將此受精卵(或著床前胚胎細(xì)胞)再植入受體動(dòng)物的輸卵管(或子宮)中,，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,，通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因和實(shí)驗(yàn)小鼠表型的關(guān)系，研究揭示外源基因的功能,，而且可進(jìn)行工程動(dòng)物的大量生產(chǎn),。
Gorden等報(bào)道了顯微注射法用于轉(zhuǎn)基因小鼠的制備。本法是早,，且應(yīng)用成功率較高的一種轉(zhuǎn)基因方法,。其基本步驟如下：
1．同步獲得供體雌鼠（注射激素的雌鼠與正常雄鼠交配而得）和假孕受體母鼠（正常雌鼠與結(jié)扎雄鼠交配產(chǎn)生),。
2．供體鼠注射絨毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵,。
3. 用顯微注射法將純化的外源基因注射進(jìn)受精卵的原核內(nèi),。
4. 受精卵鑒定 ,，將存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的輸
卵管(或子宮)內(nèi),，飼養(yǎng)后鑒定是否受孕以及個(gè)體發(fā)育狀況。
5. 子代鼠外源基因整合和表達(dá)的檢測(cè),。
6. 轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立,。
[優(yōu)點(diǎn)]
（1）外源基因在宿主染色體上的整合率相對(duì)較高；
（2）此法導(dǎo)入外源基因無(wú)需載體,；
（3）轉(zhuǎn)基因小鼠得率在60%-80%,；
（4）導(dǎo)入的外源基因可長(zhǎng)達(dá)50kb。[不足之處]
（1）外源基因隨機(jī)整合,；
（2）個(gè)別原核不清晰,，需進(jìn)行特殊處理；
（3）需大型精密儀器,，費(fèi)用昂貴,；
（4）操作周期相對(duì)較長(zhǎng)。
（二）實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備
1．輸精管切除術(shù)用器材：彎式有齒鑷,、直式有齒鑷,、顯微鑷、手術(shù)剪,、自動(dòng)小
夾涂藥器,、自動(dòng)小夾、帶彎針4/0絲線(xiàn)及持針器,、直徑為10cm塑料 Petri氏
培養(yǎng)皿（內(nèi)盛70%乙醇）,。
2．手術(shù)前麻醉
2，2,，2 三溴乙醇（阿佛?。┦窍喈?dāng)有效的麻醉劑。因該試劑對(duì)光敏感,，所以應(yīng)該于4度避光保存,，新試劑用前應(yīng)進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后,，為了使麻醉劑盡快發(fā)生作用,，將小鼠放回原籠熟悉的環(huán)境中,，小鼠將會(huì)更容易松馳下來(lái)。 擠壓小鼠腳墊,，如果小鼠能感覺(jué)到此刺激,，小鼠將從擠壓部位開(kāi)始縮腿運(yùn)動(dòng)（pedal reflex），用此方法可以檢察是否麻醉*,。實(shí)驗(yàn)中小鼠無(wú)縮腿運(yùn)動(dòng),、小鼠達(dá)到手術(shù)所需的麻醉深度以及程度方可開(kāi)始手術(shù)。
三溴乙醇的反復(fù)使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎癥反應(yīng),。其他麻醉劑中,，克他命/甲苯噻嗪在獸醫(yī)界廣泛應(yīng)用，另外,，克他命/美托咪定也越來(lái)越受到青睞,，特別是在美國(guó)。我國(guó)一些實(shí)驗(yàn)室用戊鈉的效果好,特別是尾靜脈注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊鈉0.3ml左右,。
3．受精卵的采集用器材：70%乙醇,、手術(shù)剪、10mL解剖剪,、手術(shù)鑷,、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等,。
4．離體輸卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱,、眼科鑷子、5號(hào)鑷子,、
無(wú)菌30-mm組織培養(yǎng)皿,、解剖顯微鏡、透明質(zhì)酸酶,、移液管,、工作液、M16溶液（Sigma）,、3ml注射器等。
5．DNA顯微注射用器材
（1） 受精卵的收集與移動(dòng)用器材：巴氏移液管,、酒精燈,、特制吸管、玻璃刀等,。
（2） 凹玻片準(zhǔn)備：一塊標(biāo)準(zhǔn)的凹型載玻片（硅化）,、礦物油（Sigma）、工作液等,。
（3） 注射設(shè)備的設(shè)置：微型水力驅(qū)動(dòng)設(shè)備,、Hamilton Gas-Tite?注射器（250 ?l）,、
Intramedic?管道系統(tǒng)（外徑1.27mm，內(nèi)徑0.86mm）,、兩只玻璃管道連接頭,、三通管連接器、一只帶接頭的60ml塑料注射器,、一只器械套管,、礦物油等。
（4）受精卵的顯微注射用器材：凹玻片（顯微注射用）,、倒置立體相差顯微鏡
或倒置Nomarski立體光學(xué)顯微鏡,、顯微操縱器、千分尺（連接添滿(mǎn)礦物油,，且耐氣構(gòu)造的250?l漢密爾頓注射器）,、氣壓裝置(50ml充滿(mǎn)氣體的注射器) 、持卵管,、預(yù)載DNA的注射針等,。
6．輸卵管轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)備
（1） 手術(shù)試劑器材：麻醉劑（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇,、一副鈍性齒鑷,、兩副5號(hào)精細(xì)鑷子、一副10cm手術(shù)剪,、帶自動(dòng)小夾的金屬大剪,、一個(gè)小彈簧夾、外科縫線(xiàn),、解剖顯微鏡,、纖維光學(xué)照明器、載針頭的1ml注射器,、kimwipe綿紙或外科紗布,、9cm 塑料皿、工作液,、移液管和手動(dòng)移卵管等,。所有的手術(shù)器械在使用前應(yīng)該*清洗，70%乙醇消毒或高熱滅菌處理,。2）受體母鼠的準(zhǔn)備
輸卵管轉(zhuǎn)移的受體鼠應(yīng)該為4-6周齡大小,，體重在20-25克左右，嚴(yán)禁用低體重以及超重母鼠,，若體重較低,，其體能不足以維持妊娠，可能導(dǎo)致受精卵的重新吸收,；若體重較重,，麻醉劑被吸收入脂肪組織,，降低麻醉效果，可能使手術(shù)困難,，而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在,，所以手術(shù)時(shí)切掉脂肪組織可能導(dǎo)致不必要的出血，難以確認(rèn)手術(shù)時(shí)的操作對(duì)象,。出血也可能堵塞移卵管,。選擇輸卵管轉(zhuǎn)移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠，注射當(dāng)天早上母鼠可見(jiàn)精栓,。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重,，隨著體重的增加，它們將表現(xiàn)出不同程度的感覺(jué)消失,，但它們是優(yōu)良的哺育母鼠,。另外，它們的價(jià)格也便宜,。另一個(gè)成功的鼠系是B6D2F1,，它們生命力強(qiáng)并有一定雜合優(yōu)勢(shì)。
（3）麻醉劑：阿佛丁被證明是輸卵管轉(zhuǎn)移手術(shù)的有效麻醉劑,。
（三）實(shí)驗(yàn)操作程序和方法
1．鼠系克隆
（1） 動(dòng)情期的探測(cè)：在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立中母鼠動(dòng)情期的監(jiān)測(cè)有很高的技巧性,。小鼠的動(dòng)情期主要?jiǎng)澐譃樗膫€(gè)時(shí)期：
① 動(dòng)情后期：陰道口無(wú)擴(kuò)張，周?chē)M織為灰白色,，陰道口周?chē)鸁o(wú)膨大
② 間情期：陰道開(kāi)口小,，周?chē)M織為灰色或藍(lán)色。
③ 動(dòng)情前期：陰道口逐漸擴(kuò)張,，陰道周?chē)M織由粉紅色變?yōu)榧t色,。
④ 動(dòng)情期：陰道周?chē)M織顏色由紅色轉(zhuǎn)為粉紅色，陰道口背側(cè)唇可見(jiàn)條
紋,，陰道口腹側(cè)唇可見(jiàn)腫大,，陰道有分泌液外滲。
隨機(jī)選擇動(dòng)物,，任何時(shí)間都可能有20%-25%的動(dòng)物處于動(dòng)情期,。大多鼠科動(dòng)物的動(dòng)情期平均持續(xù)4-5天，所以對(duì)群居性動(dòng)物的個(gè)體進(jìn)行動(dòng)情周期的同步化處理后可能在任一時(shí)期產(chǎn)生大量發(fā)情動(dòng)物,。動(dòng)情期動(dòng)物的選擇需兩個(gè)指標(biāo)：陰道周?chē)M織色澤和組織膨脹的程度,。動(dòng)情期動(dòng)物陰道組織深粉紅色，但并不同于炎癥時(shí)的色澤,。另外,，陰道口周?chē)掣共拷M織腫脹而有光澤,，起初其腹部可見(jiàn)條紋,。個(gè)別陰道口組織色澤較深,，但無(wú)膨脹，或陰道口稍微擴(kuò)大且略帶灰色者為非動(dòng)情期動(dòng)物,，切勿誤選它們用于交配,。
（2）交配的確認(rèn)：陰栓形成。動(dòng)物合籠后,，確定雄性個(gè)體是否與母鼠成功交配非常有必要,。由于雄性精液可在陰道內(nèi)凝固成柔軟栓性物，成功交配后不久有陰道栓形成,。以手的中指,、小指和拇指捏住雌性尾根處，使小鼠頭部向下,，仔細(xì)觀察陰道口部位,，交配過(guò)的雌性小鼠可見(jiàn)有白色橡皮擦狀的陰道栓，易肉眼所見(jiàn),，難以確定時(shí)可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在,。檢查陰栓應(yīng)在每天早上的早些時(shí)間，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移,，陰栓將被排出體外,。
2．輸精管切除術(shù)：輸精管切除小鼠用于與晶胚轉(zhuǎn)移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進(jìn)行輸精管切除術(shù),，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。
（1） 稱(chēng)重后麻醉小鼠,，背位固定小鼠,，大剪刀貼近皮膚剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手術(shù)切口部位,，以防止毛發(fā)污染切口,。
（2） 于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開(kāi)下腹部皮膚，作約1cm的切口,，
用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發(fā),。
（3） 切開(kāi)腹膜，進(jìn)行膀胱定位,。每側(cè)都可見(jiàn)有一條管道走行,，用鑷子輕輕夾
持左側(cè)管道，提起部分使手術(shù)視野清晰可見(jiàn),，確定其為輸精管,。
（4） 將鑷子插進(jìn)輸精管下方，使它們處于自然狀態(tài)，其末端垂直,。同時(shí)在該
位置兩端用縫線(xiàn)結(jié)扎輸精管,，距離大約4-5毫米。在兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸精管,，置其于紗布上確定此側(cè)手術(shù)完畢,。
（5） 將輸精管兩個(gè)斷端輕輕放回腹腔，如上處理右側(cè)輸精管,。兩側(cè)手術(shù)完畢后,，2-3根單獨(dú)縫線(xiàn)縫合腹壁切口。待用縫線(xiàn)須浸泡在70%乙醇中,，保持縫線(xiàn)濕潤(rùn),，防止結(jié)扎時(shí)粘附組織。用兩個(gè)或三個(gè)自動(dòng)小夾夾閉皮膚,。（6） 為保暖包裹小鼠于紗布中或?qū)⑵浞胖糜跓釅|內(nèi)使其蘇醒,，處于麻醉狀態(tài)
下的小鼠應(yīng)該嚴(yán)格監(jiān)護(hù)直到其*蘇醒。手術(shù)后小鼠飼養(yǎng)2周后確定手術(shù)是否成功,。
（7） 實(shí)驗(yàn)性飼養(yǎng)：將1-2只母鼠與輸精管切除小鼠合籠飼養(yǎng),，次晨進(jìn)行陰道栓檢查。有陰道栓的母鼠,，用磷酸緩沖液處理后24小時(shí),，其輸卵管潮紅。卵細(xì)胞應(yīng)該處于單細(xì)胞期或未受孕狀態(tài),，若處于雙細(xì)胞期,，則輸精管切除未*，雄性小鼠應(yīng)進(jìn)行再篩選,。
3．受精卵的收集
（1）受精卵的采集：受精卵獲得的方法分自然排卵和激素誘發(fā)排卵以及體外受精三種方法,。本章對(duì)誘發(fā)排卵法給予介紹。
誘發(fā)排卵法：雌性小鼠生后6—8周達(dá)到性成熟,，性周期均為4—5 日,，其排卵時(shí)間可用飼養(yǎng)室的明亮和黑暗進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以必須對(duì)飼養(yǎng)室的明暗規(guī)律進(jìn)行準(zhǔn)確嚴(yán)格地管理,。
性周期是卵泡刺激素和黃體生成素相互作用的結(jié)果,，我們可以從外部給予這些激素誘發(fā)排卵。向成熟雌小鼠腹腔內(nèi)注射5單位(IU)的孕馬血清促性腺激素(PMSG)之后,，約在48—54h后再將2.5-5.0 IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔內(nèi),，約12h后即可誘發(fā)排卵。排卵數(shù)量可達(dá)自然排卵的2倍,，效果很好,。雌小鼠給予hCG后應(yīng)立刻與雄性合籠,。成熟雄小鼠應(yīng)按每籠飼養(yǎng)1只，雄性小鼠大小在12周齡到1年,。合籠時(shí),，須將激素化雌性小鼠放進(jìn)雄小鼠的籠中。雄小鼠釋放促雌性發(fā)情的外激素,，在交配過(guò)程中建議不換籠，交配過(guò)的雄小鼠,，間隔一周后才進(jìn)行下次交配,。
顯微注射的受精卵于交配后次晨注射前幾小時(shí)收集，此時(shí)易進(jìn)行注射操作,。交配后過(guò)夜小鼠的陰道栓易見(jiàn),，可用交配指示劑指示。對(duì)超排卵的交配母鼠體內(nèi)進(jìn)行陰道栓計(jì)數(shù)一般正常,。低比率的有栓母鼠說(shuō)明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配過(guò)度或雄性小鼠老齡化,。收獲受精卵必須打開(kāi)小鼠腹腔，輸卵管必須仔細(xì)切開(kāi),。輸卵管沖洗術(shù)或輸卵管壺部切開(kāi)術(shù)都可作為收集受精卵的方法,。
（2）腹腔內(nèi)輸卵管的切開(kāi)
1） 通過(guò)斷頸或二氧化碳吸入快速處死小鼠。
2） 將動(dòng)物背位固定在無(wú)菌干燥的吸水紙上,，剪毛并用70%的乙醇*涂搽手術(shù)部位,。以避免毛發(fā)污染手術(shù)視野。
3） 持眼科鑷捏緊下腹部正中線(xiàn)皮膚,，用外科剪作小的橫切口,，剪刀鈍性分離充分暴露手術(shù)視野，或鈍性撕開(kāi)皮膚暴露腹膜,。用眼科剪打開(kāi)腹膜,，充分暴露腹腔與子宮角部手術(shù)視野。子宮為Y形,，為起自盆腔膀胱后的肌性器官,，向上分支為兩側(cè)子宮角，向上橫行深入腹腔,。
4） 用鑷子距輸卵管卵巢6-7mm處夾持子宮角翻轉(zhuǎn)后輕輕拖出腹腔,，在鑷子捏點(diǎn)下部子宮角下方附近刺破腸系膜，清除腸系膜組織遠(yuǎn)離子宮角與輸卵管,，并防止用力過(guò)大壓破子宮角與輸卵管連接處,。
5） 用鑷子拖出脂肪墊，卵巢,，輸卵管以及子宮部件,。小心剪掉卵巢與輸卵管之間的薄層膜,，然后剪下輸卵管和部分子宮角，將其盛放在盛工作液的小玻璃皿中,，對(duì)另一側(cè)輸卵管重復(fù)上面操作,，完畢后如上處理下一只動(dòng)物。
（3）離體輸卵管內(nèi)受精卵的收集：解剖鏡下觀察近輸卵管漏斗部上部明顯潮紅此為壺腹部,。用眼科鑷子撕開(kāi)膨大的壺腹部即看到包繞受精卵的丘細(xì)胞團(tuán),。
1）轉(zhuǎn)移輸卵管于含工作液的小玻璃皿中。
2）眼科鑷子夾持壺腹部,，并用另一只眼科鑷子撕開(kāi)膨大的輸卵管,，游離的受精卵慢慢流出，也可以用鑷子輕輕擠壓輸卵管將受精卵推出裂口,。
（4）透明質(zhì)酸酶處理與受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成團(tuán)狀,，微注射用的受精卵必須是單個(gè)細(xì)胞，而且無(wú)細(xì)胞碎片,。漂洗細(xì)胞時(shí),，首先用工作液除去細(xì)胞碎片。不成團(tuán)細(xì)胞可用無(wú)菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中,，注意把握移液管的張力,。溶解在工作液中的透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞團(tuán)以及復(fù)合體進(jìn)行消化時(shí)必須嚴(yán)密觀察，一旦細(xì)胞團(tuán)溶解立即將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮工作液中,，防止消化過(guò)度,。
用工作液漂洗2-3次，清除碎片后,，用無(wú)菌移液管將受精卵置于特殊培養(yǎng)基（M16）,，放于37?C, 5% CO2孵箱中待注射，此培養(yǎng)基上層覆蓋高壓消毒礦物油,，可防止污染同時(shí)防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)影響pH,。受精卵在體外發(fā)育較體內(nèi)快，在孵育過(guò)程中注意觀察一些受精卵清晰可見(jiàn)原核形成,，在此期間可先選出原核清晰的卵(形態(tài)稍不規(guī)則)用于注射,，其它卵繼續(xù)培養(yǎng)。注射后,，再篩選,，再注射，直至得到滿(mǎn)意的注射卵數(shù),。