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免疫熒光技術(shù)
閱讀：179 發(fā)布時(shí)間：2018-9-7| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 22KB |
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直接免疫熒光法測(cè)抗原
基本原理
將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便,、特異性高,，非特異性熒光染色少,。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體,。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查,。
試劑與儀器
l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L,，pH7.4
l 熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋
l 緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L,，pH7.4的PBS 1500ml）
l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
l 熒光顯微鏡
l 玻片架
l 濾紙
l 37℃溫箱等,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上,，10min后棄去,，使標(biāo)本保持一定濕度,。
2. 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,，使其*覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，保溫一定時(shí)間（參考：30min）,。
3. 取出玻片，置玻片架上,，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過(guò)0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸3-5 min，不時(shí)振蕩,。
4. 取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥,，加一滴緩沖甘油,，以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察,。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,，一般可用“+”表示：
（-）無(wú)熒光,；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱,，但清楚可見,；（++）熒光明亮；（+++ --++++）熒光閃亮,。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++”以上,，而各種對(duì)照顯示為（±）或（-），即可判定為陽(yáng)性,。
注意事項(xiàng)
1. 對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過(guò)1：20,，抗體濃度過(guò)低,，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過(guò)弱，影響結(jié)果的觀察,。
2. 染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,，染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí)，一般30 min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強(qiáng)染色效果，但對(duì)不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長(zhǎng)染色時(shí)間,。低溫染色過(guò)夜較37℃30 min效果好的多。
3. 為了保證熒光染色的正確性,，試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
（1） 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS,。
（2） 特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。
（3） 陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。
如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽(yáng)性染色,。
4. 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察,，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。
間接免疫熒光法測(cè)抗體
基本原理
染色程序分為兩步,，步,，用未知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min,，使抗原抗體充分結(jié)合,，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體,。第二步,，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體,。如果步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),，標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體,。
試劑與儀器
l 磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L,，pH7.4
l 緩沖甘油：分析純無(wú)熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
l 熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L,，pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋 ,。
l 搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
l 有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|）
l 熒光顯微鏡
l 玻片架
l 濾紙
l 37℃溫箱等,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。
2. 滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。
3. 取出玻片，置于玻片架上,，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min，不時(shí)振蕩 ,。
4. 取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體,。
5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。
6. 重復(fù)操作3,。
7. 取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片,。
8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法,。
注意事項(xiàng)
1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ,，會(huì)使熒光減弱,。
2. 每次試驗(yàn)時(shí) ，需設(shè)置以下三種對(duì)照：
（1） 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物
（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物
3. 已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中,，始終保持濕潤(rùn),，避免干燥。
4. 所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色,。