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免疫熒光技術

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直接免疫熒光法測抗原

基本原理

將熒光素標記在相應的抗體上,,直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高,,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低,;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體,。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查,。

試劑與儀器

l          磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

l          熒光標記的抗體溶液:以0.01mol/L,,pH7.4的PBS進行稀釋

l          緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

l          搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01mol/L,,pH7.4的PBS 1500ml)

l          有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)

l          熒光顯微鏡

l          玻片架

l          濾紙

l          37℃溫箱等。

實驗步驟

1. 滴加0.01mol/L,,pH7.4的PBS于待檢標本片上,,10min后棄去,使標本保持一定濕度,。

2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,,使其*覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),,保溫一定時間(參考:30min),。

3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,,pH7.4的PBS沖洗后,,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,,每缸3-5 min,,不時振蕩。

4. 取出玻片,,用濾紙吸去多余水分,,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,,以蓋玻片覆蓋,。

5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,,一般可用“+”表示:

(-)無熒光,;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,,但清楚可見,;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮,。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性,。

注意事項

1. 對熒光標記的抗體的稀釋,,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應超過1:20,,抗體濃度過低,,會導致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結果的觀察,。

2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,,染色時間可以從10 min到數(shù)小時,一般30 min已足夠,。染色溫度多采用室溫(25℃左右),,高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,,延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3. 為了保證熒光染色的正確性,,試驗時需設置下述對照,,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

(1)   標本自發(fā)熒光對照:標本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS,。

(2)   特異性對照(抑制試驗):標本加未標記的特異性抗體,,再加熒光標記的特異性抗體。

(3)   陽性對照:已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體,。

如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,,陽性對照和待檢標本呈強熒光,則為特異性陽性染色,。

4. 一般標本在高壓汞燈下照射超過3min,,就有熒光減弱現(xiàn)象,,經(jīng)熒光染色的標本在當天觀察,,隨著時間的延長,熒光強度會逐漸下降,。

 

間接免疫熒光法測抗體

基本原理

染色程序分為兩步,,步,用未知未標記的抗體(待檢標本)加到已知抗原標本上,,在濕盒中37℃保溫30min,,使抗原抗體充分結合,然后洗滌,,除去未結合的抗體,。第二步,加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG,、IgM抗體,。如果步發(fā)生了抗原抗體反應,標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合,,從而可鑒定未知抗體,。

試劑與儀器

l          磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

l          緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制,。

l          熒光標記的抗人球蛋白抗體:以0.01mol/L,,pH7.4的PBS進行稀釋 。

l          搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01mol/L,,pH7.4的PBS 1500ml)

l          有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)

l          熒光顯微鏡

l          玻片架

l          濾紙

l          37℃溫箱等,。

實驗步驟

1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標本片,,10min后棄去,,使標本片保持一定濕度。

2. 滴加以0.01mol/L,,pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本,,覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min,。

3. 取出玻片,,置于玻片架上,先用0.01mol/L,,pH7.4的PBS沖洗1-2次,,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,,每缸5min,,不時振蕩 。

4. 取出玻片,,用濾紙吸去多余水分,,但不使標本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體,。

5. 將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),,37℃保溫30min。

6. 重復操作3,。

7. 取出玻片,,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,,再覆以蓋玻片,。

8. 熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結果判定同直接法,。

注意事項

1. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,,或于4℃保存4h,時間過長 ,,會使熒光減弱,。

2. 每次試驗時 ,需設置以下三種對照:

(1)   陽性對照:陽性血清+熒光標記物

(2)   陰性對照:陰性血清+熒光標記物

(3)   熒光標記物對照:PBS+熒光標記物

3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中,,始終保持濕潤,,避免干燥。

4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物,,應始終保持在已知抗原標本片上,,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色,。

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