化工儀器網(wǎng)
資料下載
從小鼠中分離內(nèi)皮細(xì)胞
閱讀：197 發(fā)布時(shí)間：2018-9-3| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 68.8KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 查看 | 下載次數(shù) | 112次 |
| 資料類(lèi)型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 197次 |
| 免費(fèi)下載 | 點(diǎn)擊下載 |
內(nèi)皮細(xì)胞分布于整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)，從心臟到小的毛細(xì)血管,。在這個(gè)步驟中,，氣管的活力很非常重要。取出器官和開(kāi)始消化之間的時(shí)間越短將提高細(xì)胞更有活力的產(chǎn)出及不在含氧量低的條件下太久,。小鼠的數(shù)量需要：小鼠應(yīng)該是5~6周大小,。年齡大的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)出會(huì)少些。少5個(gè)小鼠可以得到很好的產(chǎn)出,。
一,、材料和試劑
1. 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑（ECGS）（Sigma，catalognumber：E2759）
2. 膠原酶I（Invitrogen,，Catalognumber：17100-017）
3. BSA
4. DMEM
5. FCS
6. Antibiotic
7. Heparin
8. F12medium
9. Isoflourane
10. Ethonol
11. Dynabeads
12. anti-CD31antibody（BDPharmingen,，catalognumber：550274）
13. M199
14. gelatin
二、設(shè)備
1. 離心機(jī)
2. 無(wú)菌培養(yǎng)櫥
3. 磁鐵
三,、步驟
1. 取小鼠的肺
（1）麻醉小鼠直到小鼠半睡,。我們通常用吸入的麻醉劑例如異氟醚。
（2）用70%乙醇消毒小鼠的皮膚和手術(shù)器械,。橫切小鼠,，低但平行于膈，然后穿過(guò)肋骨切開(kāi)暴露胸腔,，迅速切除肺,，放到冰上預(yù)冷的DMEM,。一旦所有的肺都取好后,，移到無(wú)菌培養(yǎng)櫥進(jìn)行下面的步驟。
（3）切碎肺組織,，清洗幾次去除血液,，用3 ml 消化液37°C培養(yǎng)45分鐘（3×15 min withpipettingbetween）離心,。
（4）將肺組織切的更細(xì)（到大約1 mm 的碎片）并放到5 ml 消化液中37度消化。用手不斷晃動(dòng)混合物,，每五分鐘換一次消化混合物,。為了這樣做，離下碎片,，去除上清,，用5 ml 預(yù)熱的消化溶液代替培養(yǎng)基并繼續(xù)混合。
（5）加入1/10體積的血清到消化溶液中,。這將失活酶并讓細(xì)胞附著,。將細(xì)胞放到組織培養(yǎng)塑料上1小時(shí)。這個(gè)預(yù)鋪?zhàn)尦衫w維細(xì)胞附著而不是內(nèi)皮細(xì)胞（EC）,。
（6）去除未附著的細(xì)胞,，離心200×g 5 min，然后直接進(jìn)入富集步驟,。
2. 富集內(nèi)皮細(xì)胞
用抗體包被免疫磁珠分離內(nèi)皮細(xì)胞：加入25 ul 免疫磁珠（1x107）到一個(gè)1.5 ml 離心管中,，用1 ml PBS洗磁珠兩次，加入100 μg anti-CD31抗體到100 μl PBS到免疫磁珠并4°C慢搖24小時(shí),。用磁鐵收集anti-CD31包被的磁珠,。當(dāng)管在磁鐵里時(shí)去除上清，4°C用PBS洗磁珠洗3次,，一次10分鐘,，終4°C過(guò)夜。用磁鐵收集磁珠,，去除上清,。4°C，用500 μl PBS/0.1%BSA重懸,，使到達(dá)一個(gè)2×107beads/ml 的終濃度,。
3. 用磁珠分離內(nèi)皮細(xì)胞
（1）在離心細(xì)胞后（200×g，5 min）,，加入15%FBS+M199,。37°C，用15%FBS+M199洗細(xì)胞3次,，200×g,，5 min 沉淀細(xì)胞。
（2）在1-2%FBS+M199重懸,，使終濃度為10-40×106cells/ml,。
（3）按1：10比例磁珠加入到內(nèi)皮細(xì)胞中（內(nèi)皮細(xì)胞大約為總細(xì)胞的0.02%）
（4）4°C旋轉(zhuǎn)珠沉淀物30分鐘。將管放到磁鐵上2-3分鐘,，去除上清,，用2 ml M199重懸磁珠,。重復(fù)4次。
（5）為了從anti-CD31抗體包被的磁珠中釋放細(xì)胞,，加入含5 mM EDTAPBS并37°C旋轉(zhuǎn)10分鐘,。
（6）洗完四次后，將珠放到培養(yǎng)培養(yǎng)基中,。對(duì)于培養(yǎng)鼠的內(nèi)皮細(xì)胞,，在鋪細(xì)胞前，預(yù)先用0.2%明膠包被平板