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內(nèi)皮細(xì)胞分布于整個循環(huán)系統(tǒng),，從心臟到小的毛細(xì)血管,。在這個步驟中，氣管的活力很非常重要,。取出器官和開始消化之間的時間越短將提高細(xì)胞更有活力的產(chǎn)出及不在含氧量低的條件下太久,。小鼠的數(shù)量需要：小鼠應(yīng)該是5~6周大小。年齡大的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的產(chǎn)出會少些,。少5個小鼠可以得到很好的產(chǎn)出。
 
一,、材料和試劑
1.  內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（ECGS）（Sigma,，catalognumber：E2759）
2.  膠原酶I（Invitrogen，Catalognumber：17100-017）
3.  BSA
4.  DMEM
5.  FCS
6.  Antibiotic
7.  Heparin
8.  F12medium
9.  Isoflourane
10.  Ethonol
11.  Dynabeads
12.  anti-CD31antibody（BDPharmingen,，catalognumber：550274）
13.  M199
14.  gelatin
 
二,、設(shè)備
1.  離心機
2.  無菌培養(yǎng)櫥
3.  磁鐵
 
三、步驟
1.  取小鼠的肺
（1）麻醉小鼠直到小鼠半睡,。我們通常用吸入的麻醉劑例如異氟醚,。

（2）用70%乙醇消毒小鼠的皮膚和手術(shù)器械。橫切小鼠,，低但平行于膈,，然后穿過肋骨切開暴露胸腔,，迅速切除肺，放到冰上預(yù)冷的DMEM,。一旦所有的肺都取好后,，移到無菌培養(yǎng)櫥進(jìn)行下面的步驟。

（3）切碎肺組織,，清洗幾次去除血液,，用3 ml 消化液37°C培養(yǎng)45分鐘（3×15 min withpipettingbetween）離心。

（4）將肺組織切的更細(xì)（到大約1 mm 的碎片）并放到5 ml 消化液中37度消化,。用手不斷晃動混合物,，每五分鐘換一次消化混合物。為了這樣做,，離下碎片,，去除上清，用5 ml 預(yù)熱的消化溶液代替培養(yǎng)基并繼續(xù)混合,。

（5）加入1/10體積的血清到消化溶液中,。這將失活酶并讓細(xì)胞附著。將細(xì)胞放到組織培養(yǎng)塑料上1小時,。這個預(yù)鋪讓成纖維細(xì)胞附著而不是內(nèi)皮細(xì)胞（EC）,。

（6）去除未附著的細(xì)胞，離心200×g 5 min,，然后直接進(jìn)入富集步驟,。

2.  富集內(nèi)皮細(xì)胞
用抗體包被免疫磁珠分離內(nèi)皮細(xì)胞：加入25 ul 免疫磁珠（1x107）到一個1.5 ml 離心管中，用1 ml PBS洗磁珠兩次,，加入100 μg anti-CD31抗體到100 μl PBS到免疫磁珠并4°C慢搖24小時,。用磁鐵收集anti-CD31包被的磁珠。當(dāng)管在磁鐵里時去除上清,，4°C用PBS洗磁珠洗3次,，一次10分鐘，終4°C過夜,。用磁鐵收集磁珠,，去除上清。4°C,，用500 μl PBS/0.1%BSA重懸,，使到達(dá)一個2×107beads/ml 的終濃度。

3.  用磁珠分離內(nèi)皮細(xì)胞
（1）在離心細(xì)胞后（200×g,，5 min）,，加入15%FBS+M199。37°C，用15%FBS+M199洗細(xì)胞3次,，200×g,，5 min 沉淀細(xì)胞。

（2）在1-2%FBS+M199重懸,，使終濃度為10-40×106cells/ml,。

（3）按1：10比例磁珠加入到內(nèi)皮細(xì)胞中（內(nèi)皮細(xì)胞大約為總細(xì)胞的0.02%）

（4）4°C旋轉(zhuǎn)珠沉淀物30分鐘。將管放到磁鐵上2-3分鐘,，去除上清,，用2 ml M199重懸磁珠。重復(fù)4次,。

（5）為了從anti-CD31抗體包被的磁珠中釋放細(xì)胞,，加入含5 mM EDTAPBS并37°C旋轉(zhuǎn)10分鐘。

（6）洗完四次后,，將珠放到培養(yǎng)培養(yǎng)基中,。對于培養(yǎng)鼠的內(nèi)皮細(xì)胞，在鋪細(xì)胞前,，預(yù)先用0.2%明膠包被平板