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TNF的生物活性測定
閱讀：271 發(fā)布時(shí)間：2018-8-20| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 22KB |
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1． 材料和試劑
1.1培養(yǎng)液A ：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）,。
1.2培養(yǎng)液B：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）和終濃度為0.7--1μg/ml
的放線菌素D。
1.3 L929細(xì)胞株：鼠結(jié)締組織纖維母細(xì)胞,，來源于22天雄性C3H鼠皮下組織,。
1.4 結(jié)晶紫染色溶液：0。05%結(jié)晶紫 (50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇,加蒸餾水定容至100ml),，蒸餾水稀釋,。
1.5 脫色液：（1）乙二醇獨(dú)甲醚50%,，蒸餾水稀釋。
（2）乙醇50%,，乙酸0.01%(V/V),，蒸餾水稀釋。
1.6 胰酶：消化貼壁L929細(xì)胞,。
1.7 半效稀釋度TNF標(biāo)準(zhǔn)品：1000IU/ml,。
2. 實(shí)驗(yàn)用具
超凈工作臺，細(xì)胞培養(yǎng)烘箱,，酒精燈,，顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)器,，微量移液器,，細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞稀釋槽,，酶標(biāo)儀,。
3. 操作步驟
3．1樣板：棄L929細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入800—900μl胰酶消化細(xì)胞,，細(xì)胞收縮后,，棄胰酶，加入4ml培養(yǎng)液A,，吹打細(xì)胞,，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),，并計(jì)算所需細(xì)胞總數(shù),，培養(yǎng)液體積，將消化好未貼壁的細(xì)胞重新懸浮于*培養(yǎng)液A,，并調(diào)整細(xì)胞濃度為10×104/ml左右并將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中,，每孔100μl,37°C，5%CO2
培養(yǎng)過夜或24小時(shí),，待細(xì)胞貼滿板壁80%以上時(shí),，方可加樣。
3．2 樣品處理和稀釋：將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用培養(yǎng)液B溶解至1 ml,，（樣品為凍干粉狀）,。如標(biāo)準(zhǔn)品為1000IU/ml，10倍稀釋至100IU/ml作為起始濃度,，樣品則根據(jù)實(shí)際情況都做10倍梯度稀釋,，并以低濃度定為起始濃度（以上操作均在24孔板中操作）。
從樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中的起始濃度中取200μl加入到96孔板A2-A12中,，其余各孔均加入150μl培養(yǎng)液B,，再從A2-A12中各取50μl,，對B-H各排進(jìn)行逐級四倍梯度稀釋.
3．3 加樣：標(biāo)準(zhǔn)品和樣品經(jīng)稀釋后，吸去已經(jīng)培養(yǎng)好的細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液,，每孔依次加樣100μl,，并在邊緣未加樣的各孔加入100μl培養(yǎng)液B，消除邊緣效應(yīng),，放入烘箱37°C,，5%CO2，培養(yǎng)過夜,。
3．4 染色和脫色：L929細(xì)胞培養(yǎng)過夜后,，鏡檢在半數(shù)死亡孔到達(dá)D或E時(shí)終止反應(yīng)，吸取上清,，輕輕吹打2—3次,，除死細(xì)胞，每孔加入染色液30μl,，靜置5分鐘左右,。
用流水輕輕沖掉染色液，每孔加入100μl脫色液脫色,，輕輕搖動(dòng)使脫色*,，然后于酶標(biāo)儀570nm波長下比色，測O.D.值,并設(shè)對照.
4. 處理數(shù)據(jù):在座標(biāo)紙上以570nm O.D.值(雙孔加樣測兩點(diǎn)值的平均)對稀釋倍數(shù)做圖,并以標(biāo)準(zhǔn)品的低,高O.D.之平均值做一平行于X軸的直線交各曲線,以各相應(yīng)曲線與該直線交點(diǎn)在X軸上讀出半效量的稀釋度,按下式計(jì)算效價(jià):
TNF成品活性(IU/ml)=標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)*(樣品預(yù)稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))*(標(biāo)準(zhǔn)品半效量稀釋度/樣品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋度)