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單層貼壁細(xì)胞-細(xì)胞毒性試驗-四唑鹽（MTT）比色法-實戰(zhàn)篇
閱讀：462 發(fā)布時間：2018-8-14單層貼壁細(xì)胞四唑鹽（MTT）比色法
僅供參考 MTT常用濃度為5mg/ml;
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《動物細(xì)胞培養(yǎng)--基本技術(shù)指南》
注：此書中MTT濃度為50mg/ml
1,、藥物的細(xì)胞毒性
四唑鹽（MTT）比色法
操作步驟
接種細(xì)胞
（1）用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，將細(xì)胞收集到含血清的培養(yǎng)基中,。
（2）離心細(xì)胞懸液,使細(xì)胞沉積下來,。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù),。
（3）將細(xì)胞稀釋至2.5×103-50×103 個/ml,每個微滴定板可容納20ml細(xì)胞重懸液,。
（4）用加樣器在平底96孔板中間十列的各孔中加入200μl細(xì)胞懸液，每孔加0.5×103-10×103 個細(xì)胞,。
（5）將200μl培養(yǎng)基加至第1列和第12列的8個孔中,。第1列作讀板議的空白對照。
（6）將培養(yǎng)板放至塑料飯盒中,，于37℃濕潤環(huán)境中溫育1-3天,，等細(xì)胞進入指數(shù)生長期時可加入藥物。
添加藥物
（7）用培養(yǎng)基將細(xì)胞毒性藥物5倍系列稀釋,，共制備8個濃度,。
（8）對于貼壁生長的細(xì)胞,，去除第2-11列各孔的培養(yǎng)基。
（9）在第2列和第11列的8個孔中加入200μl新鮮配制的培養(yǎng)基,，這些細(xì)胞作為對照,。
（10）在第3-10列的細(xì)胞中加入細(xì)胞毒性藥物。每個藥物濃度僅需4個孔,，這樣A-D行可用于種藥物,，E-H行用于第二種藥物。
（11）向每組4 孔中各加入200μl藥物溶液,。
（12）將培養(yǎng)板放回塑料盒中,，溫育至確定時間。
生長期
（13）在藥物作用期結(jié)束時,，去除所有含有細(xì)胞的孔中的培養(yǎng)基,，加入200μl新鮮的培養(yǎng)基。
（14）每日換液至2-3個PDTs[群體倍增時間],。
存活細(xì)胞數(shù)的估算
（15）在生長期末,，每孔中各加入200μl新鮮的培養(yǎng)基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT,。
（16）用鋁箔包裹培養(yǎng)板,，于37℃濕潤環(huán)境中溫育4 h。
（17）棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT,，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸緩沖液（每孔25μl）,。
（19）立即在570nm處記錄吸光值,。讀板儀用第1 列中含培養(yǎng)基和MTT但不含細(xì)胞的各孔調(diào)零。
分析
以藥物濃度為橫坐標(biāo)（X軸）,，吸光值為縱坐標(biāo)（Y軸）繪制曲線圖,。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值，對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為IC50 濃度,。
四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán),，
? 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞沒有這種功能,。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比,。再用酶標(biāo)儀測定OD值,。
無菌材料
? 生長液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA,，1mmol/L,溶于PBSA中）,；MTT： 3- (4,5) -雙甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑,，50mg/ml,濾過除菌; Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH將PH調(diào)至10.5 ）;微滴定板（Linbro,ICN）; 微吸頭，放在高壓滅菌的吸頭盒中,。
非滅菌材料的準(zhǔn)備
? 塑料盒（無毒的聚苯乙烯,，裝培養(yǎng)板用）；加樣器,；DMSO；ELISA讀板儀,。
體會(更新中)
1,、盡管細(xì)胞計數(shù)很重要，考慮到使用血細(xì)胞計數(shù)板所測結(jié)果的不穩(wěn)定性,，建議不要過分依賴它,。將細(xì)胞懸液大體計數(shù)并稀釋后，用微量加樣器分裝入一96孔板的 幾個孔內(nèi)（舊板亦可）,，鏡下觀察細(xì)胞密度是否合適,。
2、加樣時使用多道加樣器,，盡可能減少加樣誤差,。加樣時請注意槍頭有無氣泡產(chǎn)生，避免液體吸入加樣器,，勤換槍頭,，頻率自己掌握。