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細(xì)胞周期測(cè)定的方法步驟
閱讀：847 發(fā)布時(shí)間：2018-8-10| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 233.8KB |
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一,、原理
細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間,。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期,。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。
單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法,，但它不能代表細(xì)胞群體的周期,，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。
測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多,，有同位素標(biāo)記法,、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法,。
BrdU （5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后,，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后,，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期,，則染色體中約一半為兩條單體均淺染,，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期,，則兩條單體均深染,。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值,。
二,、儀器、用品與試劑
1,、儀器,、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇,、冰醋酸,，Giemsa染液，秋水仙素,，2×SSC液
三,、操作步驟
1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí),，向培養(yǎng)液中加入BrdU,，使終濃度為10μg/ml。
2,、44小時(shí)加秋水仙素，使每毫升中含0.1μg,。
3,、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中,。
4,、常規(guī)染色體制片。
5,、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘,。
6,、棄去2×SSC液，流水沖洗,。
7,、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗,，晾干,。
8、鏡檢100個(gè)分裂相,，計(jì),、二、三,、四細(xì)胞期分裂指數(shù),。
9、計(jì)算：
細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1＋2M2＋3M3 ＋4M4）/100}（小時(shí)）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存,。
?。?）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml,，4℃保存,。