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細胞周期測定的方法步驟
閱讀：856 發(fā)布時間：2018-8-10| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 233.8KB |
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一,、原理
細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期,。細胞周期反應(yīng)了細胞增殖速度,。
單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期,，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期,。
測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法,、細胞計數(shù)法等,，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU （5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后,，可做為細胞DNA復(fù)制的原料,，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染,。如經(jīng)歷了三個周期,，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺,。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期,，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,，就可算出細胞周期的值,。
二、儀器,、用品與試劑
1,、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)
2,、試劑：BrdU（1.0mg/ml）,，甲醇、冰醋酸,，Giemsa染液,，秋水仙素，2×SSC液
三,、操作步驟
1,、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU,，使終濃度為10μg/ml,。
2、44小時加秋水仙素,，使每毫升中含0.1μg,。
3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中,，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中,。
4、常規(guī)染色體制片,。
5,、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液,，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘,。
6、棄去2×SSC液,，流水沖洗,。
7,、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗,，晾干,。
8、鏡檢100個分裂相,，計,、二、三,、四細胞期分裂指數(shù),。
9、計算：
細胞周期（Tc）=48/{（M1＋2M2＋3M3 ＋4M4）/100}（小時）
附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存,。
?。?）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克,，加水至100ml,，4℃保存。