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細胞支原體污染的熒光檢測方法
閱讀：208 發(fā)布時間：2018-8-8| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 29.9KB |
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DNA熒光染色法：
1.原理：利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染,。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%）,，所以可將其染色而偵測,。被支原體污染之細胞經(jīng)染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點,，即為支原體之DNA,，證明有支原體之污染,。
2.測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養(yǎng) 液接種于指示細胞培養(yǎng)液中（indicator cell,，例如Vero cell or 3T6 cell）,，然后培養(yǎng)指示細胞再作熒光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對照,。
3.待測細胞亦可作直接測試,，但需為吸附型細胞,，培養(yǎng)后直接作熒光染色,。有些細胞易有熒光背景,，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟,。
4.特點：簡單,、經(jīng)濟與靈敏，廣泛使用,，可作為例行之偵測步驟,?？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體,，例如M. hyorhinis,，較直接培養(yǎng)法快，約一星期即可知道結果,。
5.缺點：有時仍會有熒光背景,，影響判讀,。
材料：
1.Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014：,、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125),、0.1M citric acid,、02M disodium phosphate、glycerol,、glacial acetic acid、methanol,、strerile H2O,、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片：浸于酒精內(nèi),，使用前過火滅菌：，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上,。染色后取出蓋玻片,，細胞面朝下放在玻片上觀察。
2.Indicator cells：Vero(African green monkey kidney,ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070),，細胞須先測試無污染,。αMEM with 10%FBS( medium for Vero cell)
配制試劑：
1.無菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌,。勿用高壓蒸汽滅菌,。
2.Hoechst 33258 stock solution（100X）：稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中,，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中,，貯存于-20℃,。
3.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中,，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆,，避免光照,，貯存于4℃,。
4.mounting solution：22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要）,，貯存于4℃。
5.固定溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1：3之體積比例混合,，使用前才配制,。
步驟：
1.培養(yǎng)Vero細胞： Vero細胞可作長期培養(yǎng)或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養(yǎng),。測試前一周培養(yǎng)Vero細胞。
2.在接種測試樣品前一日,，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液,，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液,，于37℃, 5％CO2培養(yǎng),。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品,。
3.接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基，1ml待測細胞培養(yǎng) 液（可將細胞稍微刮下：,，0.05~0.1ml冷凍管之細胞懸浮液,。
4.將測試樣品加入chamber slide內(nèi)，培養(yǎng)5天后,，進行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
5.以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組：或是已感染支原體之細胞培養(yǎng) 液或冷凍細胞液：,，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM +10%FBS),。
6.DNA熒光染色檢測：
①取出培養(yǎng)5日之Vero細胞，吸除培養(yǎng)液,。于每個well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液,，靜置10 min后，吸除固定液,。重復上述之步驟,，風干10分鐘。②于每個well中,，加入1ml Hoechst 33258 working solution,，室溫下靜置30min,。③吸掉Hoechst 33258染液后,，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution,，并以蓋玻片覆蓋之,。④以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后,，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡,，觀察細胞核外是否有藍色熒光小點或是絲狀點之熒光物產(chǎn)生,。
結果判讀：
若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色熒光小點或是絲狀點,。其形狀一致,，與細胞殘片染成之不規(guī)則點狀物不同。其熒光可維持數(shù)星期,。
圖例 (A)為negative result ： 熒光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核,，測試樣品沒有支原體的污染,。(為positive result ： 在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色熒光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染,。
(A)Negative result
熒光顯微鏡下,，只觀察到Vero細胞的細胞核,，測試樣品沒有支原體的污染,。