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DNA熒光染色法：

1.原理：利用熒光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染,。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%）,，所以可將其染色而偵測,。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn),，即為支原體之DNA,，證明有支原體之污染。

2.測試步驟用間接步驟,，將待測細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng) 液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中（indicator cell,，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作熒光染色,。正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對(duì)照,。

3.待測細(xì)胞亦可作直接測試，但需為吸附型細(xì)胞,，培養(yǎng)后直接作熒光染色,。有些細(xì)胞易有熒光背景，而干擾結(jié)果判讀,，則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟,。

4.特點(diǎn)：簡單、經(jīng)濟(jì)與靈敏,，廣泛使用,，可作為例行之偵測步驟?？梢詡蓽y不易培養(yǎng)之支原體,，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快,，約一星期即可知道結(jié)果。

5.缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有熒光背景,，影響判讀,。

材料：

1.Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014：、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883),、thimerosol (Sigma T-5125),、0.1M citric acid,、02M disodium phosphate、glycerol,、glacial acetic acid,、methanol、strerile H2O,、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無菌22x22mm蓋玻片：浸于酒精內(nèi),，使用前過火滅菌：，一般吸附型細(xì)胞均能吸附在蓋玻片上,。染色后取出蓋玻片,，細(xì)胞面朝下放在玻片上觀察。

2.Indicator cells：Vero(African green monkey kidney,ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070),，細(xì)胞須先測試無污染,。αMEM with 10%FBS( medium for Vero cell)

配制試劑：

1.無菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌,。勿用高壓蒸汽滅菌,。

2.Hoechst 33258 stock solution（100X）：稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中,，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至*溶解后,，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20℃,。

3.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution,，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘,，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆,，避免光照，貯存于4℃,。

4.mounting solution：22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合,，以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5（pH很重要），貯存于4℃,。

5.固定溶液（fixative）：冰醋酸與甲醇以1：3之體積比例混合,，使用前才配制。

步驟：

1.培養(yǎng)Vero細(xì)胞： Vero細(xì)胞可作長期培養(yǎng)或制作多個(gè)冷凍保存管,，測試前解凍培養(yǎng),。測試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。

2.在接種測試樣品前一日,，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細(xì)胞,，制成細(xì)胞懸浮液，以1~2x10^4 cells／ml培養(yǎng)于chamber slide中，每個(gè)well加入1ml細(xì)胞懸浮液,，于37℃, 5％CO2培養(yǎng),。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品,。

3.接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養(yǎng)基,，1ml待測細(xì)胞培養(yǎng) 液（可將細(xì)胞稍微刮下：，0.05~0.1ml冷凍管之細(xì)胞懸浮液,。

4.將測試樣品加入chamber slide內(nèi),，培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst 33258的熒光染色觀察,。

5.以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細(xì)胞作為正反應(yīng)對(duì)照組：或是已感染支原體之細(xì)胞培養(yǎng) 液或冷凍細(xì)胞液：,，負(fù)反應(yīng)對(duì)照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM +10%FBS)。

6.DNA熒光染色檢測： 
①取出培養(yǎng)5日之Vero細(xì)胞,，吸除培養(yǎng)液,。于每個(gè)well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后,，吸除固定液,。重復(fù)上述之步驟，風(fēng)干10分鐘,。②于每個(gè)well中,，加入1ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30min,。③吸掉Hoechst 33258染液后,，以無菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的mounting solution,，并以蓋玻片覆蓋之,。④以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后,，以UV激發(fā)光束(330～380 nm)之濾光鏡,，觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之熒光物產(chǎn)生。 
結(jié)果判讀：

若有支原體污染,，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn),。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同,。其熒光可維持?jǐn)?shù)星期,。
圖例 (A)為negative result ： 熒光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核,，測試樣品沒有支原體的污染,。(為positive result ： 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測試樣品有支原體的污染,。

(A)Negative result 
熒光顯微鏡下,，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測試樣品沒有支原體的污染,。