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PCR引物溶解稀釋方法
閱讀：2592 發(fā)布時(shí)間：2018-8-7| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 16.1KB |
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在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子克隆實(shí)驗(yàn)時(shí),，經(jīng)常需要合成大量的引物,，而這些合成的引物首先要進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尣拍苁褂?。如果不稀釋就使用引物,，往往造成引物的浪費(fèi)和過(guò)早的活性喪失,，更有一些被污染而不能使用。
因此,，建議對(duì)合成的引物先進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笫褂?。稀釋的引物利于保存和?yīng)用。
現(xiàn)將方法簡(jiǎn)單敘述如下：
1. Oligo DNA是以O(shè)D260單位來(lái)計(jì)算的,，這是指在1ml體積1cm光程標(biāo)準(zhǔn)比色皿中,，260nm波長(zhǎng)下吸光度為1A260的Oligo溶液定義為1 OD260單位,，根據(jù)此定義，1 OD260單位相當(dāng)于33μg的Oligo DNA,，您可以根據(jù)此數(shù)據(jù)和您的Oligo DNA分子量,，計(jì)算得到摩爾數(shù)以計(jì)算不同摩爾濃度的溶液。
2. 引物序列的分子量計(jì)算公式如下：
MW=（A堿基數(shù)×312）+（C堿基數(shù)×288）+（G堿基數(shù)×328）+（T堿基數(shù)×303）-61
例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6
MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541
3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法計(jì)算：Oligo DNA中的每個(gè)脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5,，則一條Oligo DNA的分子量=堿基數(shù)×324.5,。
例：
您得到一管標(biāo)為5 OD260的20 mer Oligo DNA
分子量=20×324.5=6490
質(zhì)量數(shù)=5×33=165μg
摩爾數(shù)=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加滅菌雙蒸水400μl溶解，則濃度為25nmol/400μl=62.5μM
4. 裝有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,，臨用前稀釋,。
5. 由于Oligo DNA呈很輕的干膜狀附在管壁上，打開(kāi)時(shí)極易散失,，所以打開(kāi)管子前請(qǐng)先離心10,000rpm,1min,然后再慢慢打開(kāi)管蓋,。
6. 在裝有引物的eppendorf管內(nèi)加入100-500μl雙蒸水，蓋上管蓋,，充分上下振蕩5-10分鐘,，再次離心10,000rpm,1min。
7. 計(jì)算原引物管primer的濃度（必要時(shí)測(cè)OD260核對(duì)廠家提供引物量是否正確）,。
8. 計(jì)算并將應(yīng)用primer稀釋為10pmol/μl,。
9. 標(biāo)明原引物管,、應(yīng)用引物管,、稀釋方法，置-20℃保存,。