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禽流感病毒H5和H7亞型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)用途 本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法檢測(cè)禽組織,、分泌物,、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5

（AIV-H5）和 H7 亞型（AIV-H7）的 RNA,，適用于 AIV-H5、AIV-H7 的檢測(cè),、診斷和流行病學(xué)調(diào)查,。 原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,，以 RNA 為模板,，以引 物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈,。在熱啟動(dòng) Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性,、中溫退火及 延伸的循環(huán),，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交,，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性,，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào),，利用 熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào),，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線(xiàn)的形成情況判定結(jié)果。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)試劑盒組成

保存期 本產(chǎn)品有效期為 12 個(gè)月,。

需要自備的器材

1．儀器：分析天平,、離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀,、組織研磨器,、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL,、20

µL,、200 µL、1000 µL）,。

2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管,、眼科剪、眼科鑷,、生理鹽水,、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL,、200 µL,、1000 µL）、滅菌雙蒸水,。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)使用注意事項(xiàng)

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置,，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

2．PCR  整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū),、模板提取區(qū),、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū),。嚴(yán) 禁器材和試劑倒流,。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化,，8000 rpm 離心 15 s,， 使液體全部沉于管底,，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取,，使用后立 即放回-20 ℃,。

4．在 RNA 提取過(guò)程中，避免 RNA 酶污染,，盡量縮短操作時(shí)間,。

5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過(guò)有效期限的試劑,，試劑盒之間的成分不要混用。

6．嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得好的結(jié)果,。操作過(guò)程中移液,、定時(shí)等全部過(guò)程必須。

7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制,，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格控制污染,。

8．反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完,，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管,、腦,、胸肌、心肌和肺等組織,；待檢活禽,，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中,。2～8 ℃保存,，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮,， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約 1g,，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨,，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中,，8000 rpm 離心 2 min,，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2  陽(yáng)性對(duì)照處理：取陽(yáng)性對(duì)照 100 µL,，置 1.5 mL 滅菌離心管中,。

2.3  陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照 100 µL,，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟

1 病毒 RNA 的提取

1.1 取已處理的樣品,、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻,，室溫靜置 3～

5 min,。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),，以免離心時(shí) 堵塞吸附柱）,，13000 rpm 離心 30 s。

1.3  棄去收集管中液體,，加入 600 µL 洗液,，13000 rpm 離心 30 s。

1.4 重復(fù)步驟 1.3,。

1.5 棄去收集管中液體,，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液,。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中,，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min,，13000 rpm

離心 30 s,，離心管中液體即為模板 RNA。

2 實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作

設(shè)被檢樣品,、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N,，每份總體積 20µL，反應(yīng)體系配制如下：

將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后,，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 15 µL,。

分別取 5 µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中,，混勻并作好標(biāo)記,，其中 AIV-H7 熒光報(bào)告基團(tuán)為 FAM，AIV-H5 為 HEX,，淬滅基團(tuán)均為 None（如果儀器沒(méi)有 HEX 校正過(guò),，可暫時(shí)用 VIC 代替）。在 熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：45 ℃ 15 min,，95 ℃ 1min,；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s,，在每個(gè)循環(huán)第二步

（60℃ 35s）收集熒光信號(hào),，共 40 個(gè)循環(huán),。

結(jié)果判定

1 結(jié)果分析條件設(shè)定 閾值設(shè)定原則：閾值線(xiàn)設(shè)定于剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線(xiàn)的高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音

情況進(jìn)行調(diào)整,。

2  結(jié)果描述及判定

陽(yáng)性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn),，陰性對(duì)照無(wú) Ct 值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果成立,；被檢樣品若 FAM 熒光信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)為 H7 陽(yáng)性,；被檢樣品若 Hex 熒光信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)為 H5 陽(yáng)性；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn),， 需重新取樣提取 RNA,，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑,，可判定為陽(yáng)性,；被檢樣品 Ct 值≥35 時(shí)， 超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍,，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn) S 型曲線(xiàn),，但本底較高的樣品,，應(yīng)為陰 性。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)