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禽流感病毒H5和H7亞型雙重實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書用途 本試劑盒采用實時熒光 RT-PCR 方法檢測禽組織,、分泌物,、排泄物及尿囊液中禽流感病毒 H5

（AIV-H5）和 H7 亞型（AIV-H7）的 RNA，適用于 AIV-H5、AIV-H7 的檢測,、診斷和流行病學調查,。 原理 利用離心柱內硅基質膜提取樣品總 RNA,，在反轉錄酶的作用下，以 RNA 為模板,，以引 物為起點合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈,。在熱啟動 Taq 酶的作用下，經高溫變性,、中溫退火及 延伸的循環(huán),，使特異 DNA 片段的拷貝數放大一倍，經熒光素標記的探針與擴增的 DNA 雜交,，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性,，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出特異性熒光信號,，利用 熒光 PCR 儀檢測特異性熒光信號,，根據樣品 Ct 值的大小及擴增曲線的形成情況判定結果。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書試劑盒組成

保存期 本產品有效期為 12 個月,。

需要自備的器材

1．儀器：分析天平,、離心機、熒光 PCR 擴增儀,、組織研磨器,、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL,、20

µL,、200 µL,、1000 µL）。

2．耗材：熒光 PCR 反應管,、眼科剪,、眼科鑷、生理鹽水,、1.5 mL 經焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管,、吸頭（10 µL、200 µL,、1000 µL）,、滅菌雙蒸水。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書使用注意事項

1．所有接觸病料的物品均應合理處置,，以免污染實驗室,。

2．PCR  整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū),、擴增區(qū),。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴增區(qū)。嚴 禁器材和試劑倒流,。

3．所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存,。-20℃保存的各試劑管使用前應*融化，8000 rpm 離心 15 s,， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中,，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取,，使用后立 即放回-20 ℃。

4．在 RNA 提取過程中,，避免 RNA 酶污染,，盡量縮短操作時間。

5．注意防止試劑盒組分受污染,。不要使用超過有效期限的試劑,，試劑盒之間的成分不要混用。

6．嚴格遵守操作說明可以獲得好的結果,。操作過程中移液,、定時等全部過程必須。

7．反應體系應在特定配液區(qū)或者超凈工作臺中配制,，整個實驗過程嚴格控制污染,。

8．反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應在 3 次內用完,，請嚴格按試劑盒說明書操作,。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺禽,，取喉氣管、腦,、胸肌,、心肌和肺等組織；待檢活禽,，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物,，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存,，送實驗室檢測,。（要求送檢病料新鮮， 嚴禁反復凍融,。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理,。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨,，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min,，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中,。

2.2  陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中,。

2.3  陰性對照處理：取陰性對照 100 µL,，置 1.5 mL 滅菌離心管中。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書操作步驟

1 病毒 RNA 的提取

1.1 取已處理的樣品,、陰性對照和陽性對照,，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻,，室溫靜置 3～

5 min,。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質,，以免離心時 堵塞吸附柱）,，13000 rpm 離心 30 s。

1.3  棄去收集管中液體,，加入 600 µL 洗液,，13000 rpm 離心 30 s。

1.4 重復步驟 1.3,。

1.5 棄去收集管中液體,，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液,。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中,，向柱中央加入洗脫液 50 µL,，室溫靜置 1 min，13000 rpm

離心 30 s,，離心管中液體即為模板 RNA,。

2 實時熒光 RT-PCR 操作

設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為 N,，每份總體積 20µL,，反應體系配制如下：

將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各 15 µL,。

分別取 5 µL 模板 RNA,，加入相應反應管中，混勻并作好標記,，其中 AIV-H7 熒光報告基團為 FAM,，AIV-H5 為 HEX，淬滅基團均為 None（如果儀器沒有 HEX 校正過,，可暫時用 VIC 代替）,。在 熒光 PCR 儀上進行以下反應：45 ℃ 15 min，95 ℃ 1min,；95 ℃ 5 s,，60 ℃ 35 s，在每個循環(huán)第二步

（60℃ 35s）收集熒光信號,，共 40 個循環(huán),。

結果判定

1 結果分析條件設定 閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的高點。不同儀器可根據儀器噪音

情況進行調整,。

2  結果描述及判定

陽性對照 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線,，陰性對照無 Ct 值并且無特定擴增曲線，實驗結 果成立,；被檢樣品若 FAM 熒光信號 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線為 H7 陽性；被檢樣品若 Hex 熒光信號 Ct 值≤30 并出現特定的擴增曲線為 H5 陽性,；被檢樣品 30＜Ct＜35 并出現特定的擴增曲線,， 需重新取樣提取 RNA，擴增后進行結果判定,，如仍是可疑,，可判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥35 時,， 超過本方法檢測靈敏度范圍,，判定為陰性；對于某些未呈現 S 型曲線,，但本底較高的樣品,，應為陰 性,。

禽流感病毒H5和H7亞型雙重實時熒光RT-PCR 試劑盒說明書