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細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之Caspase-3活性檢測(cè)法
閱讀：379 發(fā)布時(shí)間：2018-7-23| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 17.6KB |
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實(shí)驗(yàn)方法原理 Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能,。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段,，它被激活,，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降,。
實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞
試劑,、試劑盒 Ac-DEVD-AMC磷酸緩沖液蒸餾水脫脂奶粉Caspase-3多抗吐溫
儀器、耗材 硝酸纖維素膜PVDF膜熒光分光光度計(jì)UV流式細(xì)胞計(jì)燒杯移液管引流棒
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、Western blot 分析Procaspase-3的活化,，以及活化的Caspase-3及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,，PARP]等的裂解,。
1. 方法
收集細(xì)胞→PBS洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉(zhuǎn)移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2 h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次,，5~10 min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG或AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2 h→ TBS-T洗3次,， 5~10 min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
2. 結(jié)果
二,、 熒光分光光度計(jì)分析
1. 原理
活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物,，水解D4-X肽鍵,。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC,。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí),，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC,，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光,。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性,，從而反映Caspase-3被活化的程度,。
2. 方法
收獲細(xì)胞正常或凋亡細(xì)胞→PBS洗滌→制備細(xì)胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）→37°C反應(yīng)1 h→熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380 nm,，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460 nm）,。
3. 結(jié)果
三、流式細(xì)胞術(shù)分析
1. 方法
收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞→PBS洗滌→加Ac-DEVD-AMC→37°C反應(yīng)1 h→UV流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度,。
2. 結(jié)果