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免疫組化SABC法與SV法
閱讀：337 發(fā)布時(shí)間：2018-7-19| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 82.1KB |
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實(shí)驗(yàn)原理
SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡(jiǎn)便而敏感的免疫組化染色方法。
親和素(Avidin)存在于雞蛋中,，分子量67000。是一種堿性蛋白質(zhì),，具有對(duì)生物素近乎于共價(jià)鍵的結(jié)合力,。鏈霉親和素是一種從鏈霉菌(Streptomyces Avidinii)培養(yǎng)物中所提取的蛋白質(zhì)，分子量47000,，不含糖鏈,，等電點(diǎn)IP=6.0-6.5。和親和素一樣,，也有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn),，親和力高達(dá)10-15M,。和親和素相比，鏈霉親和素更為?，F(xiàn)在經(jīng)過(guò)改進(jìn)的親和素等電點(diǎn)IP可以達(dá)到7.0,，明顯地消除了原堿性蛋白特征所引起的非特異性吸附。
生物素是一種水溶性維生素(即維生素H),，分子量244,。生物素活化后，可以標(biāo)記抗體和酶而不影響其活性,。鏈霉親和素—酶復(fù)合物可以起到放大信號(hào)的作用,，這是SABC具有高度敏感性的基礎(chǔ)。
SV(Super Vision)兩步法：是用聚合標(biāo)記方法將過(guò)氧化物酶連接到二抗上,，形成類(lèi)似于章魚(yú)的超大分子抗體-酶聚合物,，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗。這種聚合物擁有強(qiáng)大的信號(hào)放大能力,，同時(shí)有很強(qiáng)的組織細(xì)胞滲透力,，經(jīng)檢測(cè)其靈敏度高于同類(lèi)產(chǎn)品，特別是針對(duì)核抗原,，其滲透性特別強(qiáng),，適合免疫組化的應(yīng)用。此系列檢測(cè)試劑與傳統(tǒng)的三步法比較具有簡(jiǎn)單,，快速,，高敏感，低背景等特點(diǎn),。
原理示意圖：
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 即用型SABC(過(guò)氧化物酶)試劑盒(博士德貨號(hào)SA1021,，SA1022)
2. 即用型SV(HRP辣根過(guò)氧化物酶)試劑盒(博士德貨號(hào)SV0001，SV0002)
3. DAB(黃色,，博士德貨號(hào)AR1022)
4. Mayor`s蘇木素(博士德貨號(hào)AR0005)
5. 所選一抗：KCA3.1(BA1788),；PCNA(BM0104)；Vimentin(BM0135)( 博士德公司)
6. 3%H2O2
7. 5%BSA封閉液
8. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)
9. 飽和Na2HPO4溶液
10. 中性樹(shù)膠
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
微波爐,，37℃恒溫箱,，超薄切片機(jī)
實(shí)驗(yàn)材料
乳腺癌石蠟切片,，腸癌石蠟切片,，切片厚度為5微米
實(shí)驗(yàn)步驟
SABC法：
1. 切片脫蠟至水；
2. 新鮮配置3%H2O2,，室溫10分鐘,，滅活內(nèi)源性酶，然后用蒸餾水沖洗2分鐘三次,；
3. 微波修復(fù)：將切片放入盛有PBS緩沖液(PH7.2-7.6)的杯子中,，在微波爐里加熱煮沸,，微波爐中靜置５分鐘，拿出室溫冷卻６分鐘,，再微波續(xù)熱至沸騰后*室溫冷卻,；
4. 滴加5%BSA封閉液，37℃反應(yīng)30分鐘,。甩去多余液體,，不洗；
5. 滴加一抗,，4℃反應(yīng)過(guò)夜,。所配一抗的濃度為1µg/ml；
6. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次,，滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反應(yīng)30分鐘,；
7. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次，滴加試劑SABC,，37℃反應(yīng)30分鐘,，PBS洗30分鐘×3次；
8. DAB室溫顯色,，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,，蒸餾水洗滌；
9. 滴加蘇木素輕度復(fù)染60秒,，蒸餾水洗滌后浸入飽和Na2HPO4溶液中2分鐘,，取出后洗滌，37℃恒溫箱干燥過(guò)夜,，中性樹(shù)膠封片,。
SV法：
1. 切片脫蠟至水；
2. 新鮮配置3%H2O2,，室溫10分鐘,，滅活內(nèi)源性酶，然后用蒸餾水沖洗2分鐘三次,；
3. 微波修復(fù)：將切片放入盛有PBS緩沖液(PH7.2-7.6)的杯子中,，在微波爐里加熱煮沸，微波爐中靜置5分鐘,，拿出室溫冷卻６分鐘,，再微波續(xù)熱至沸騰后*室溫冷卻；
4. 滴加5%BSA封閉液,，37℃反應(yīng)30分鐘,。甩去多余液體，不洗,；
5. 滴加一抗,，4℃反應(yīng)過(guò)夜,，所配一抗的濃度為1µg/ml；
6. PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗10分鐘×3次,，滴加HRP標(biāo)記二抗IgG (抗兔或抗鼠)37℃反應(yīng)30分鐘,，PBS緩沖液(PH7.2-7.6)洗30分鐘×3次；
7. DAB室溫顯色,，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,，蒸餾水洗滌；
8. 滴加蘇木素輕度復(fù)染60秒,，蒸餾水洗滌后浸入飽和Na2HPO4溶液中2分鐘,，取出后洗滌，37℃恒溫箱干燥過(guò)夜,，中性樹(shù)膠封片,。