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果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP)試劑盒說明書 

                                            微量法100管/96樣

 

注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

果糖-1,6二磷酸酶又稱果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機(jī)磷,，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用,。

 

測定原理：

FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,，340nm下測定NADPH增加速率,，即可計(jì)算FBP活性。

 

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、恒溫水浴鍋,、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

 

試劑的組成和配制：

提取液一：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

提取液二：液體100mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存,；臨用前加入20mL試劑四充分溶解待用,，用不完的試劑4℃保存；

試劑二：液體7.2μL×1支,，4℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用,，用不完的試劑4℃保存,；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存,；臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用,，用不完的試劑4℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶,， 4℃保存,；

 

樣本的前處理：

①總FBP酶提取：建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W,，破碎3s,，間歇7s，總時(shí)間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定。

②胞漿和葉綠體FBP酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一）,，冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min,，棄沉淀,，取上清在4℃，8000g離心10min,，取上清用于測定胞漿FBP酶活性,，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W,，破碎3s，間歇7s,，總時(shí)間1min）,，然后4℃，8000g離心10min,，取上清測定葉綠體中FBP酶活性,。

建議測定總FBP酶活性，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FBP,，則按照步驟②提取粗酶液。

 

測定步驟：

1,、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 將試劑一、二,、三37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘,。

3、 加樣表：

將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中,，立即混勻,，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在340 nm波長下記錄反應(yīng)1min后吸光度A1和反應(yīng)6min后的吸光度A2,，計(jì)算ΔA=A2-A1,。

 

FBP活性計(jì)算：

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.02 mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

 

b. 用96孔板測定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位,。

FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4 L,；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm；V樣：加入樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,。