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酸性磷酸酶（ACP）活性測定試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

                                                  分光光度法50管/24樣

 

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。

測定意義：                           

ACP在酸性條件下催化磷酸單酯水解稱無機(jī)磷酸,，常見于巨噬細(xì)胞的溶酶體內(nèi),。ACP常用于前列腺癌的輔助診斷,。

 

測定原理：

在酸性環(huán)境中,，ACP催化對硝基苯磷酸二鈉水解生成4-硝基苯酚，在405nm有特征光吸收,；通過測定405nm吸光度增加速率,，來計(jì)算ACP活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、臺式離心機(jī),、分析天平、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、冰、可調(diào)式移液器和蒸餾水,。

 

試劑組成和配制：

試劑一：液體60mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑三：液體25mL×1瓶，4℃保存,。

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粗酶液提?。?/span>

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,，4℃,、10000g離心10min，取上清液待測,。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）；然后10000g,，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3. 血液可直接測定,，或者適當(dāng)稀釋后測定。

 

測定：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到405 nm,。

2. 在 EP 管中加入下列試劑

混勻,，吸取 1 mL 加入玻璃比色皿中，405 nm 下測定各管吸光值,。ΔA=A測定管-A對照管,。

注意：每個測定管需做一個對照管。

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ACP活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 14.6672x + 0.0179,；R² = 0.9996,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值ΔA,。

1. 血液中ACP活性計(jì)算

活性單位定義：30℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 4-硝基苯酚定義為1個酶活單位,。

ACP活力(μmol/min/mL)=（ΔA-0.0179）÷14.6672 ×V反總÷T÷V樣

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）

2. 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ACP活性計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：30℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 4-硝基苯酚定義為1個酶活單位,。

ACP活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反總÷T÷(V樣×Cpr)

=0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：30℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol 4-硝基苯酚定義為1個酶活單位,。

ACP活力 (μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0179)÷14.6672×V反總÷T÷(W×V 樣÷V 樣總)

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：30℃中每10⁴個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol 4-硝基苯酚定義為1個酶活單位。

ACP活力 (μmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.0179)÷14.6672 ×V反總÷T ÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）

= 0.2273 ×（ΔA-0.0179）÷細(xì)胞數(shù)量

V反總：反應(yīng)體系總體積（mL）,，1 mL,； W ：樣品質(zhì)量，g,； V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積（mL）,，0.01 mL；V樣總：提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min），30 min,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬。

 

注意事項(xiàng)：

ACP不穩(wěn)定,，尤其在37℃和pH大于7的條件下活力喪失快,，因此酸性磷酸酶樣品一般需當(dāng)天準(zhǔn)備；血清樣品中，每毫升血清中加入10mg檸檬酸氫二鈉或者5mg硫酸氫鈉,，使pH降至6.5以下,，或5ml血清加入30%醋酸溶液2～3滴，置于4℃可保存1周,。

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