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磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實驗步驟

分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

植物葉綠體中磷酸丙糖異構(gòu)酶是光合作用中參與calvin循環(huán)的重要酶,。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮之間的轉(zhuǎn)化,，磷酸二羥丙酮能快速透過葉綠體的包膜進入細胞質(zhì)，并在其中逐步轉(zhuǎn)化為蔗糖,。

測定原理：

磷酸丙糖異構(gòu)酶將磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛,，3-磷酸甘油醛與NAD在3-磷酸甘油醛脫氫酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm處的吸光度變化反映了磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性的高低,。

自備實驗用品及儀器：

天平,、低溫離心機、研缽,、震蕩儀,、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿,。

試劑組成和配制：

提取液一：液體50mL×1瓶,，4℃保存。

提取液二：液體50mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑一：液體30mL×1瓶，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存,。臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

試劑四：粉劑×1瓶,，-20℃避光保存。臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融。

磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實驗步驟酶液提?。?/span>

①總TPI酶提?。?/span>建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定。

②胞漿和葉綠體TPI酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本,，加入1mL提取液一）,，冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min,，棄沉淀,，取上清在4℃，8000g離心10min,，取上清用于測定胞漿TPI酶活性,，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎3s,，間歇7s,，總時間1min），然后4℃,，8000g離心10min,，取上清測定葉綠體中TPI酶活性。

建議測定總TPI酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的TPI,，則按照步驟②提取粗酶液。

測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 取1mL石英比色皿,，依次加入600μL試劑一,，100μL試劑二，100μL試劑三,，100μL試劑四,，100μL粗酶液，充分混勻,，記錄340nm處10s的吸光值A1和310s的吸光值A2,，△A=A2-A1

計算公式：

（1）按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。

TPI（nmol/min /mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。

TPI（nmol/min /g 鮮重）= ΔA÷（ε×d）×V反總÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積,，1mL；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.1mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應(yīng)時間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g

磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）試劑盒實驗步驟