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多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點(diǎn)
閱讀：348 發(fā)布時(shí)間：2022-4-22多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點(diǎn)
分光光度法50管/24樣
注 意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白,，可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化,，與果實(shí)成熟、葉和花的脫落,、病原物防御,，細(xì)胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關(guān)，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領(lǐng)域具有較高的研究?jī)r(jià)值,。
測(cè)定原理：
多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸,，具有還原性醛基，與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì),，在540nm有特征吸收峰,，測(cè)定540nm處吸光值變化可計(jì)算得多聚半乳糖醛酸酶活性。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平,、低溫離心機(jī),、可見分光光度計(jì)、1 mL玻璃比色皿,、恒溫水浴鍋,。
試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存,。
試劑一：液體20mL×1瓶,，4℃保存。
試劑二：液體25mL×1瓶,，4℃避光保存,。
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點(diǎn)酶液提取：
1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。16000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。
2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時(shí)間3min）,；然后16000g，4℃離心10min,，取上清置于冰上待測(cè),。
3．培養(yǎng)液：直接檢測(cè)。
測(cè)定操作表：
對(duì)照管 | 測(cè)定管 | |
樣本（μL） | 100 | |
煮沸樣本（μL） | 100 | |
試劑一（μL） | 400 | |
蒸餾水（μL） | 400 | |
40℃水浴30min | ||
試劑二（μL） | 500 | 500 |
沸水浴5min，冰浴或自來水冷卻,，蒸餾水調(diào)零,，1mL玻璃比色皿測(cè)定540nm處吸光值A，△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管,。每個(gè)測(cè)定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管,。 | ||
酶活性計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996,；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,，mg/mL；y為吸光值,。
1．按照蛋白濃度計(jì)算
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點(diǎn)酶活性定義：
在40℃,，pH6.0條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。
PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下，每克樣本每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。
PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3．按液體體積計(jì)算
酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。
PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)
4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：在40℃,，pH6.0條件下，每104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位,。
PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量
V反總：反應(yīng)總體積,，0.5mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積,，0.1mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；W,，樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，0.5h
注意事項(xiàng)：
煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘，以將酶*滅活,。
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點(diǎn)