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中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                      分光光度法  50管/24樣

 

注    意： 正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。 

測(cè)定意義：

NP在一定的溫度和中性pH條件下,，催化水解蛋白質(zhì),。由于其安全無(wú)毒,、水解能力強(qiáng),、作用范圍廣等特點(diǎn),，中性蛋白酶常用于食品,、飼料,、化妝品和營(yíng)養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

 

測(cè)定原理：

中性條件下,，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸,；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán),；在680nm有特征吸收峰,。

 

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋,、磁力攪拌器,、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿,、1.5 mL EP管和蒸餾水,。

 

試劑組成和配制：

試劑一：液體90mL×1瓶，4℃保存,。

試劑二：粉劑×1瓶,，4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解,。

試劑三：粉劑×1瓶,，4℃避光保存。臨用前加入20 mL試劑一,，沸水浴中磁力攪拌溶解,。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察,，避免水分全部蒸發(fā),，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過(guò)飽和試劑,，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）,。

試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存,。臨用前加50 mL蒸餾水溶解,。

試劑五：液體10mL×1瓶，4℃保存,。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1支,，0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液，4℃保存,。

 

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g,，4℃離心10min,，取上清，即粗酶液,。

血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定,。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時(shí)間3min）；然后8000g,，4℃,，離心10min，取上清置于冰上待測(cè),。

 

測(cè)定操作：

1.分光光度計(jì)預(yù)熱30min,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到680 nm，蒸餾水調(diào)零,。

2.試劑二,、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。

3. 對(duì)照管：取一支EP管,，加入100μL粗酶液,，200μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min,；加入200μL試劑三,，混勻后8000g， 4℃離心10min,；取200μL上清液,，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四,，200μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測(cè)定光吸收,，記為A對(duì)照管,。

4. 測(cè)定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液,，200μL試劑三,，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL

 

試劑二,，混勻后8000g,， 4℃離心10min,；取200μL上清液，加入新的EP管,，再加入1000μL試劑四,，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，于680nm測(cè)定光吸收,，記為A測(cè)定管。（注意與空白管不同,，先加試劑三,，后加試劑二）

5. 空白管：取EP管，加入200μL蒸餾水,，1000μL試劑四,，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，于680nm測(cè)定光吸收,，記為A空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管,，加入200μL標(biāo)準(zhǔn)品,，1000μL試劑四，200μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，于680nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管,。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次,。

 

計(jì)算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

NP活性（nmol/min /mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位,。

NP活性（nmol/min /g鮮重）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

3. 按照液體體積計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位,。

NP活性（nmol/min/mL）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷V1÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）

按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

NP活性單位定義：30℃每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

NP活性（nmol/min /10⁴ cell）=C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/mL標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液,；V反總：酶促反應(yīng)總體積,，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL）,，0.1 mL；V2：提取液總體積（mL）,，1mL,；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min；W：樣品質(zhì)量（g）,。

 

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑配制好后4℃保存,，并且3天內(nèi)使用完畢。