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胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書
閱讀：259 發(fā)布時間：2022-3-15
胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書
分光法 50T/48S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶,。此外，胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸,、外科炎癥、潰瘍,、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫,、血腫及膿腫等的輔助治療。
測定原理：
胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵,，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng),，導(dǎo)致溶液的pH值降低，以苯酚紅為指示劑,，測定溶液在555nm處吸收值的變化,，可以快速測得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系,。
自備儀器和用品：
紫外可見分光光度計,、1mL玻璃比色皿、臺式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、研缽,、冰和蒸餾水,。
試劑組成和配制：
提取液：液體60 mL×1瓶,，4℃保存。
試劑一：液體10 mL×1瓶,，4℃保存,。
試劑二：液體10mL×1瓶，4℃避光保存,。
試劑三：液體4 mL×1瓶,，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）冰浴勻漿，10000g,，4℃離心10min,，取上清，即粗酶液,。
測定步驟：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到555 nm，蒸餾水調(diào)零,。
2. 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：蒸餾水（V）：試劑三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合,。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少,，在空瓶中配制,，試劑盒中帶有4個空瓶）
3. 吸取25μL樣本，加入975 μL工作液,，混勻后立即測定,，記錄555nm下1min時的吸光值A1和2min時的吸光值A2。計算△A=A1-A2
注 意：如果△A小于0.005,，可將反應(yīng)時間延長到5min,。如果△A大于0.5，體系迅速變色,，可將樣本用提取液稀釋后測定（建議稀釋10倍），計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),。
胰蛋白酶活性計算公式：
使用石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少1為1個酶活單位,。
胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反總 ÷（Cpr×V1）÷T
=40×△A ÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：室溫每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少1為1個酶活單位。
胰蛋白酶（U/g 鮮重）= △A×V反總÷（W×V1÷V2）÷T
=40×△A ÷W
Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定,；W：組織質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL）,，25 μL=0.025 mL,；V2：粗酶液總體積（mL）,，1 mL；V反總：反應(yīng)總體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時間（min），1 min,。