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植物線粒體核酸提取試劑盒實驗原理
閱讀：361 發(fā)布時間：2021-12-18植物線粒體核酸提取試劑盒實驗原理
Plant Mitochondrial DNA Extraction Kit
上海雅吉生物科技有限公司
線粒體 DNA 提取的關(guān)鍵是盡可能的去掉核 DNA,。本試劑盒利用差速離心得到比較純凈的線粒體,，再利用 DNA 酶消化和裂解緩沖系統(tǒng)等多步驟去掉核 DNA,，最后得到純凈的線粒體 DNA,?？捎糜?PCR 等對純度要求較高的實驗,。
本試劑盒用于從植物葉片中分離出完整而純化的線粒體,。適合于田間采摘或者實驗室培養(yǎng)的植物葉片中線粒體 DNA 的提取制備。
試劑存儲
本試劑盒整體保存于 2-8℃一年,，Dnase I -20℃保存,。使用前，在 DNase I 中加入 600ul（50T）或者 1200ul（100T）的DNA 酶反應液,，分裝后-20℃保存三個月,，如果超過三個月，活性可能會降低,，請自行訂購 DNASE I,。線粒體裂解液使用前常溫保存，如有沉淀可 37℃水浴溶解,，不影響使用,。
植物線粒體核酸提取試劑盒實驗原理使用參考
準備工作： ：在 Dnase I 中加入 600ul（50T）或者 1100ul（100T）的 DNA 酶反應液，適當分裝后-20℃保存,。線粒體裂解液保存于常溫,，如有沉淀 37℃水浴溶解，離心機溫度下降到 4℃（2-8℃），如無低溫離心機,，也可以常溫離心,，并將離心時間為 10min 的改為 5min，但最后所得 DNA 品質(zhì)及產(chǎn)量可能會有一定影響,。
1. 樣本采集前處理：無論田間自然生長還是實驗室組織培養(yǎng),，采摘前須避光生長 24-48 小時，以減少葉片組織中糖類及葉綠體含量,。取適量植物細胞裂解液,，加入 0.5% β-巰基乙醇，如 10ml 植物細胞裂解液加入 50ulβ-巰基乙醇,，混勻,，形成植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液，此溶液可 2-8 度保存一個月,。
2. 葉片用蒸餾水清洗 2-3 次,，濾紙吸干，有條件請用液氮研磨葉片 1-2 克,，研磨完后,，取 800mg 左右研磨的葉片粉，加入1.5ml 預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,，混勻,。如果無條件（無液氮），請預冷研缽,，取洗過的葉片 1000 mg,，用剪刀剪為碎塊放入玻璃勻漿器或者研缽中,。加入 1.5ml 預冷的植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,，冰上研磨至看不見明顯組織塊；
3. 將研磨物放置合適的離心管,，4℃,，1000× g 離心 5 min；
4. 將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,，在沉淀中加入 0.5ml 植物細胞裂解液/β-巰基乙醇溶液,，混勻，再次 4℃,，1000× g 離心5 min,，取上清；合并兩次上清,，將上清 4℃ 1000× g 再次離心 5 min,。
5．取上清，加入一新的離心管中,，4℃,， 16,000 × g 離心 10 min,。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白,。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,，線粒體沉淀在管底。
6. 在線粒體沉淀中加入 0.5 mL 線粒體清洗液重懸線粒體沉淀,，4℃,，1000× g 離心 5 min；
7．取上清,，加入一新的離心管中,，4℃， 16,000 × g 離心 10 min,。棄上清,，高純度的線粒體沉淀在管底；
8. 加入 100ul DNA 酶反應液重懸線粒體,，吹打均勻后,，再加入 10ul DNASE I 溶液（見準備工作），混勻,，37℃水浴 10min,。此步為消化線粒體表面吸付的核 DNA。4℃,， 12,000 × g 離心 5 min,。盡可能的棄上清，再加入 200ul TE 重懸線粒體沉淀,，4℃,，12,000 × g 離心 5 min，洗去殘留的 DNA 酶,。
9.得到的沉淀,，用 200ul TE 緩沖液重懸線粒體沉淀，加入 10ul RNase A,。加入 200ul 線粒體裂解液,，輕輕混勻（不可吹打），放置 1-2min,，再加入 150ul 蛋白沉淀液,，迅速混勻。4℃,， 12,000 × g 離心 5 min,。此步驟可進一步去除核 DNA。
10．取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析,，可加入此步：選用等體積的酚氯仿異戊醇 25:24:1 抽提一次,，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提兩次,，一般來說,，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體 DNA 的損失,，因而用于 PCR 時可省,，并不影響后續(xù)實驗），加入 0.6 倍體積的異丙醇（如無異丙醇,，可加入 2.5 倍體積的乙醇沉淀 DNA,，如離心管太滿可分兩管）及 5-10ul 核酸核酸助沉劑，混勻,，-20℃沉淀半小時左右（此步可?。?/span>4℃,， 12,000 × g 離心 10 min,。
11. 棄上清，再加入 1ml 70%乙醇清洗,，4℃,， 12,000 × g 離心 5min。重復用 70%乙醇洗一次,。
12. 棄上清,，再次離心 1min 吸棄上清，不要碰到管底,，開蓋涼干約 5-10min,。
13．加入 20-30ul TE 緩沖液,輕彈管底，37℃水浴 5 分鐘,，線粒體 DNA 溶解,。
14. 進行 DNA 電泳檢測及-20℃保存,，進行下步的實驗,。（由于部分植物線粒體本身 DNA 含量很低，可以富集多個樣本合并濃縮或進行 PCR 檢測）
植物線粒體核酸提取試劑盒實驗原理注意事項
1. 以離心力 g 計算正確的離心速度,，不同的離心機可據(jù)此精確計算離心速度,。
2. 進行 Western Blot 和 2D-膠電泳，可直接在第 7 步的沉淀中加入上樣緩沖液裂解線粒體,。
3. β-巰基乙醇有毒,，請注意通風及防護
附：一般低溫度心機都有離心力顯示，如果沒有，可以用以下公式簡單的換算,。
轉(zhuǎn)速與離心力換算
G＝1.11×(10 -5 )×R×[rpm] 2
G 為離心力,，一般以 g（重力加速度）的倍數(shù)來表示；
[rpm]2 即：轉(zhuǎn)速的平方,； R 為半徑,，單位為厘米。
植物線粒體核酸提取試劑盒實驗原理