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兩種方式都是可行的,，各有利弊。不必擔心刮刀收集會刮壞細胞,，胰酶消化的程度掌握不好,，也會讓細胞破損。胰酶消化可能會對某些膜蛋白產(chǎn)生影響,，刮刀收集效率會略低,，可根據(jù)自己的實驗來選擇細胞收集的方式。做總蛋白提取時,，可選擇直接在器皿中進行裂解,，無需提前收集。

PS：使用刮刀收集時,，可加入PBS幫助收取細胞,。

當然不是,，要根據(jù)WB的實驗目的來確定提取哪類蛋白,，如需驗證某些低豐度蛋白，或蛋白定位,，或組分間表達量對比,，則需要進行亞細胞結(jié)構分離或組分分離,。

蛋白樣品如果長期保存,，或者下游實驗過程較長,，建議加入蛋白酶抑制劑。做磷酸化研究,，一定要加入磷酸酶抑制劑,！

內(nèi)源性蛋白酶存在于胞漿中,，所以要在細胞裂解前加入抑制劑到達最佳抑制效果,，提取時將抑制劑添加到裂解液中，工作濃度1X,。例如100X蛋白酶抑制劑,，1ml裂解液中添加10ul即可。

產(chǎn)生粘稠物的主要原因是RIPA不能將所有樣品全部裂解,，產(chǎn)生的不可溶組分中主要含有核酸殘團,，細胞碎片（有些組織樣品還含有油脂），和部分蛋白,，因此RIPA提取的僅僅是可溶性蛋白,，并非真正的總蛋白。

解決方案：使用柱式法蛋白提取真正意義上的總蛋白

最好是收集完細胞后馬上進行蛋白提取。

濃度測定方法很多,，目前推薦使用兼容性較好的BCA法進行濃度測定。

蛋白樣品不建議久存,，也不要反復凍融。下游做WB實驗,，建議蛋白濃度測定后,，加入loading buffer煮樣，煮后根據(jù)實驗需要分裝成小管在-80℃,，下次使用前拿出小管再次煮樣即可,。（詳

蛋白濃度測定后，建議將各個樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可以PBS,，水或裂解液）,，加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分鐘,，使蛋白充分變性,，也可使用PCR儀95度加熱5分鐘。

PS：煮沸并非必須步驟,，膜蛋白建議70℃或者更低溫度煮,。

煮后在冰上靜置少許時間,，進行低速離心,，即可上樣。

如組織樣品中含血較多,，血紅蛋白可能會影響下游實驗， 可以在組織樣品裂解前使用紅細胞裂解液進行處理后,，再進行蛋白提取,。