日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2,、 水浴鍋

1、 PBS緩沖液（pH7.2―7.4）

2,、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）

3,、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H₂O₂ 和80%甲醇溶液配制

4、 風(fēng)裱劑：

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合

b. 油和TBS（PBS）配制

5,、 TBS/PBS pH9.0–9.5,，適用于熒光纖維鏡標(biāo)本；pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本

1,、 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘

b. 無水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2,、 抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu),，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián),，導(dǎo)致部分抗原表位封閉,，結(jié)合位點(diǎn)減少，所以需要抗原修復(fù),，以暴露原來的抗原表位,，達(dá)到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳,。

抗原修復(fù)的幾種常用方法（供參考）

1,、 微波爐加熱：

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電,，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次,。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法"3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘,，再溫火沸騰3分鐘即可。

適用的抗原：來源于人,、大鼠,、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本,。

2,、 沸熱修復(fù)：

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘,。

3,、 高壓熱修復(fù)：

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定,。將玻片置于金屬染色架上,，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,，然后將蓋子鎖定,，小閥門將會(huì)升起來。10分鐘后除去熱源,，置入涼水中,，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù),。（骨及軟骨組織的標(biāo)本最好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)） 。

4,、 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液,。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘,。

適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等,。

1、三步法（以SP試劑盒為例）

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗,，PBS浸泡5分鐘,，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行

- 3% H₂O₂ 室溫孵育5~10分鐘,，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,，PBS沖洗，2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉,，室溫孵育10分鐘,。傾去血清，勿洗,，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋）,，37℃孵育10~30分鐘,；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋）,，37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 顯色劑顯色（DAB或AEC）

- 自來水充分沖洗，復(fù)染,，脫水透明,、封片

- 如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟,、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H₂O₂ ,，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次

- 抗原修復(fù)

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液,，室溫20分鐘,，甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水,、透明,、封片、鏡檢

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm,，冰凍切片后如不染色，必須吹干,，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi),，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后,，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗,，5分鐘×3次

- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘,，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性

- PBS沖洗，5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）