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微生物菌種低溫冷凍保藏技術(shù)規(guī)程
閱讀：1440 發(fā)布時(shí)間：2021-3-301,、 安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備
用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋,。將凍存管或安瓿管清洗干凈,， 121℃下高壓滅菌15-20分鐘，備用,。
2,、 保護(hù)劑的準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇,。配制保護(hù)劑時(shí)，應(yīng)注意其濃度,，一般采用10-20%甘油,。
3、 微生物保藏物的準(zhǔn)備
微生物不同的生理狀態(tài)對(duì)存活率有影響,，一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物,。
分裝時(shí)注意應(yīng)在無菌條件下操作。
菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法：
刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體,，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi),；
接種液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi),；
將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng),，形成菌落后，用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米）,，真菌取菌落邊緣的菌塊,，與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi)；
在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基,，接種菌種,，培養(yǎng)2-10天后，加入保護(hù)劑,，待保藏,。
4、 預(yù)凍
預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好,、使樣品凍結(jié)到-35℃,。
目前常用的有三種控溫方法：
—— 程序控溫降溫法，應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置,，可以穩(wěn)定連續(xù)降溫,，能很好地控制降溫速率。
—— 分段降溫法：將菌體在不同溫級(jí)的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,，或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫,。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管,，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí),，然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃,。
—— 對(duì)耐低溫的微生物,、可以直接放入氣相或液相氮中。
5、 保藏
將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏,。一般氣相中溫度為-150℃,，液相中溫度為-196℃。
6,、 保藏周期
一般10年以上,。
7、復(fù)蘇方法
從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,，應(yīng)立即放置在38℃-40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng),。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，一般約需50秒-100秒,。開啟安瓿管或塑料凍存管,，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。