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一節(jié) 免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)（供參考）
一、免疫組化操作步驟
（一）,、儀器設(shè)備

1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2,、 水浴鍋

（二）,、試 劑

1、 PBS緩沖液（pH7.2―7.4）

2,、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）

3,、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H₂O₂ 和80%甲醇溶液配制

4、 風(fēng)裱劑：

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合

b. 油和TBS（PBS）配制

5,、 TBS/PBS pH9.0–9.5,，適用于熒光纖維鏡標(biāo)本；pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本

（三）,、操作流程

1,、 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲本中浸泡10分鐘，更換二甲本后在浸泡10分鐘

b. 無(wú)水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2,、 抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

二,、抗原修復(fù)（免疫組化石蠟切片）

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來(lái)組織的抗原結(jié)構(gòu),，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián),，導(dǎo)致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點(diǎn)減少,，所以需要抗原修復(fù),，以暴露原來(lái)的抗原表位，達(dá)到充分顯露抗原,，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳,。

抗原修復(fù)的幾種常用方法（供參考）

1、 微波爐加熱：

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入,，斷電,，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次,。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘,，再溫火沸騰3分鐘即可,。

適用的抗原：來(lái)源于人、大鼠,、小鼠的組織標(biāo)本,；來(lái)源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本。

2,、 沸熱修復(fù)：

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右,，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

3,、 高壓熱修復(fù)：

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋,，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上,，緩慢加壓,，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定,，小閥門(mén)將會(huì)升起來(lái),。10分鐘后除去熱源，置入涼水中,，當(dāng)小閥門(mén)沉下去后打開(kāi)蓋子,。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的抗原修復(fù)。（骨及軟骨組織的標(biāo)本好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)） ,。

4,、 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃,，消化時(shí)間約為5-30分鐘,。

適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

三,、石蠟切片免疫組化染色步驟

1,、三步法（以SP試劑盒為例）

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘,，如果采用抗原修復(fù),，可在此步后進(jìn)行

- 3% H₂O₂ 室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,，PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘,。傾去血清,，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液,，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過(guò)夜

- PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘,；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘,；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗,，2分鐘×3次

- 顯色劑顯色（DAB或AEC）

- 自來(lái)水充分沖洗,，復(fù)染，脫水透明,、封片

- 如果必要,，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H₂O₂ ,，室溫封閉5-10分鐘,，用蒸餾水洗3次

- 抗原修復(fù)

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘,，甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過(guò)夜或37℃1小時(shí)

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水,、透明,、封片、鏡檢

四,、冰凍切片的免疫組化染色步驟

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm,，冰凍切片后如不染色，必須吹干,，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi),，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘,，也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗,，5分鐘×3次

- 用3%過(guò)氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性

- PBS沖洗,，5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開(kāi)始）

第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）
一,、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系

我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過(guò)程如下：

一步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物,；

第二步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋,。

上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活,。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間,，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式： 抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）。

也就是說(shuō)當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長(zhǎng),；反過(guò)來(lái)當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短,，才能使抗原決定簇*暴露,，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“表1”中也可以清楚地看出。

表1 時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響

• 時(shí)間（分鐘）
• 100℃
• 80℃
• 60℃
• 5×2
• + + +
• ―
• ―
• 5×6
• + + + +
• + + +
• ―
• 5×10
• ―
• + + + +
• +
• 10小時(shí)
• ―
• ―
• + +

如果修復(fù)強(qiáng)度不夠,，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇,，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱,，或出現(xiàn)假陰性,，即使是陽(yáng)性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用,，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要,。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來(lái)困難，例如用來(lái)測(cè)定耐藥的指標(biāo),。

二,、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系

大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本,，它所形成的橋連就越緊密,，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng),。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng),，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高，這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ),。

這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件,，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度,，才可能得到比較滿(mǎn)意的結(jié)果,。

三、不同pH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響

抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響,。

pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況：

A.穩(wěn)定型,，pH值對(duì)染色結(jié)果影響不大，如PCNA,、AE1,、EMA、CD20等,；

B.V型,，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-5染色結(jié)果較差,，如ER,、Ki-67等；

C.上升型，隨著pH值的增加,，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng),，如HMB45等；

D.下降型,，隨著pH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱,，當(dāng)然這種類(lèi)型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31,。

一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意,，即在高pH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值得修復(fù)液,，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等,。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液,。綜合以上各種抗體的染色狀況,，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國(guó)外免疫組化專(zhuān)家建議,，在常規(guī)的免疫組化工作中,，全部選用高pH值得修復(fù)液來(lái)代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此,，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液,。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸,，尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以,，在常規(guī)的免疫組化工作中,，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。

四,、抗原熱修復(fù)的手段
表2 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較

•  
• 溫度
• 壓力
• 時(shí)間
• 受熱
• 微波爐
• 100℃
• 1P
• 15~20分鐘
• 不均勻
• 高壓鍋
• 120℃
• 1.2P
• 噴氣2分鐘
• 均勻

目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種,，從“表2”中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一,、節(jié)省時(shí)間,、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的青睞,。