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霍亂弧菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作程序
閱讀：3937 發(fā)布時間：2021-2-251 方法來源
1.1 進出口食品中霍亂弧菌檢測方法(SN/T 1022-2010)
1.2 衛(wèi)生部《霍亂防治手冊》第六版(2013年)
2 適用范圍
本程序規(guī)定了食品中霍亂弧菌（Vibrio cholera）的檢驗方法,。本程序適用于食品中霍亂弧菌的檢驗。
3 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,，其他設(shè)備和材料如下：
3.1 恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1 ℃,。
3.2 恒溫培養(yǎng)箱：41.5℃±1℃。
3.3 冰箱：2℃～5℃,。
3.4 恒溫水浴箱：36℃±1℃,。
3.5 均質(zhì)器或無菌乳缽。
3.6 天平：感量0.1 g,。
3.7 無菌試管：18 mm×180mm,、15mm×100mm。
3.8 無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）,、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭,。
3.9 無菌錐形瓶：容量250mL、500 mL,、1000mL,。
3.10 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。
3.11 微生物生化鑒定系統(tǒng),。
3.12 無菌手術(shù)剪,、鑷子。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1 堿性蛋白胨水：見附錄A中A.1,。
4.2 硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見附錄A中A.2,。
4.3 4號瓊脂：見附錄A中A.3。
4.4 慶大霉素瓊脂：見附錄A中A.4,。
4.5 商品化生化鑒定試劑：見附錄A中A.5,。
5 檢驗程序
6. 操作步驟
6.1 樣品處理
稱取25g樣品放入盛有225mL堿性蛋白胨水的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,，或置于盛有225mL堿性蛋白胨水的無菌均質(zhì)袋中,，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。如無均質(zhì)器,，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎,，然后放在500mL的滅菌容器內(nèi)，加225mL堿性蛋白胨水,，并充分振蕩,。
如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超過15 min,或2 ℃～5℃不超過18h解凍。
6.2 一次增菌
將深凍樣品、干品,、腌漬產(chǎn)品于36℃±1℃培養(yǎng)6h～8h,，新鮮樣品41.5℃±1℃培養(yǎng)6h～8h（如無明顯的細(xì)菌生長現(xiàn)象則繼續(xù)培養(yǎng)，但不能超過20 h）,。
6.3 二次增菌
同時吸取上述一次增菌的表層增菌液0.2mL,，加入10mL堿性蛋白胨水管中，36℃±1℃培養(yǎng)6 h～8 h,。
6.4 分離
6.4.1 在所有顯示生長的一,、二次增菌管中用接種環(huán)沾取一環(huán)表層增菌液，分別于TCBS（或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基）平板,、4號瓊脂（或慶大霉素瓊脂）平板上劃線分離,。于36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。
6.4.2 各種平板上霍亂弧菌的典型菌落特征見表1,。
表1 霍亂弧菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征
選擇性瓊脂平板 | 霍亂弧菌 |
TCBS | 圓形,、邊緣半透明而中央不透明、表面光滑的黃色菌落,，直徑約3 mm左右,。 |
科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基 | 藍(lán)色，藍(lán)綠色到綠色菌落,。 |
4號瓊脂培養(yǎng)基 | 圓形,、半透明、光滑濕潤,、灰黑色水滴樣菌落,，直徑約3 mm左右。 |
慶大霉素瓊脂平板 | 略帶青灰色,、半透明,、扁平、微隆起,、光滑濕潤,。如延長培養(yǎng)時間或室溫放置到48h， 菌落略帶黃色,，中心形成黑色金屬碲沉淀。 |
6.4.3 純培養(yǎng)
每個平板上各挑取5個或以上可疑菌落（少于5個全部挑?。?，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面（或平板），36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,。
6.5 初步鑒定
6.5.1 氧化酶試驗
挑選純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗,，霍亂弧菌為陽性。
6.5.2 粘絲試驗
挑選純培養(yǎng)的單個菌落進行粘絲試驗，霍亂弧菌為陽性,。
6.5.3 涂片鏡檢
將可疑菌落涂片,，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài),?；魜y弧菌為革蘭氏陰性，呈弧形,、逗點狀等多形態(tài),，無芽胞。
6.5.4 挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落,，轉(zhuǎn)種三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層,，36℃
±1℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果?；魜y弧菌在三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑,，無氣泡，斜面顏色變黃,。
6.6 確定鑒定
初步鑒定結(jié)果相符者用微生物生化鑒定系統(tǒng)或商品化生化鑒定試劑進行系統(tǒng)鑒定,。
6.7 血清鑒定分型
6.7.1 血清鑒定
自營養(yǎng)瓊脂斜面上挑取純培養(yǎng)物與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。玻片凝集用血清的效價一般應(yīng)為1：40～1：50,。如可疑菌落在血清中很快（一般在10 s內(nèi)）出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集,，在生理鹽水中不凝集者判為陽性。均不凝集方可報告未檢出O1群及O139群霍亂弧菌,。
6.7.2 O1群霍亂弧菌血清分型
上述確定為O1群霍亂弧菌的培養(yǎng)物,，分別使用小川型及稻葉型單價血清做玻片凝集，同時做生理鹽水對照,。
6.8 報告
當(dāng)檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要求,，同時與霍亂弧菌診斷血清凝集（生理鹽水不凝集），報告25g（mL）樣品中檢出霍亂弧菌,?；魜y弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見表2。
表1 霍亂弧菌的生化性狀
試驗項目 | 結(jié)果 |
革蘭氏染色鏡檢 | 陰性,，無芽胞 |
氧化酶 | ＋ |
粘絲試驗 | ＋ |
動力 | ＋ |
蔗糖 | ＋ |
葡萄糖 | ＋ |
分解葡萄糖產(chǎn)氣 | － |
乳糖 | －/＋ |
硫化氫 | － |
注：＋陽性,；－陰性 | |
表2 霍亂弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別
名稱 | 氧 化 酶 | 賴 氨 酸 | 精 氨 酸 | 鳥 氨 酸 | 明 膠 | 脲 酶 | V ︱ P | 42 ℃ 生 長 | 蔗 糖 | D ︱ 纖 維 二 糖 | 乳糖 | 阿 拉 伯 糖 | D ︱ 甘 露 糖 | D ︱ 甘 露 醇 | O N P G | 嗜鹽性試驗NaCl含量（％） | ||||
0 | 3 | 6 | 8 | 1 0 | ||||||||||||||||
副溶血性弧菌 | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | V | － | ＋ | － | V | － | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | － |
創(chuàng)傷弧菌 | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | ＋ | V | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － |
溶藻弧菌 | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ |
霍亂弧菌 | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | V | ＋ | ＋ | － | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － |
擬態(tài)弧菌 | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | － | － | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － |
河弧菌 | ＋ | － | ＋ | － | ＋ | － | － | V | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | V | － |
弗氏弧菌 | ＋ | － | ＋ | － | ＋ | － | － | － | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | ＋ | － |
梅氏弧菌 | － | ＋ | ＋ | － | ＋ | － | ＋ | V | ＋ | － | － | － | ＋ | ＋ | ＋ | － | ＋ | ＋ | V | － |
霍利斯弧菌 | ＋ | － | － | － | － | － | － | nd | － | － | － | ＋ | ＋ | － | － | － | ＋ | ＋ | － | － |
注：nd表示未試驗；V表示可變,。 | ||||||||||||||||||||
7. 毒力基因檢測
如鑒定結(jié)果為霍亂弧菌,，需進行ctxAB基因的檢測。注意：也可采用經(jīng)過驗證的商品化試劑盒,。
7.1 DNA模板的制備
取適量純培養(yǎng)菌落加入500μL滅菌dH2O中混勻,，煮沸10min,，15000×g離心3 min。取上清液儲存在-20℃直至使用,。也可以用商業(yè)化的DNA提取試劑盒,，按其說明提取制備DNA模板。
7.2 PCR擴增
7.2.1 引物
可使用引物對5'-ATT TTG AGG TGT TCC ATG TG-3'和5'-ATA AAGCAGTCA GGT GGT CT-3',。擴增產(chǎn)物全長749bp,。
7.2.2 陰、陽性對照設(shè)置
陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應(yīng)的模板,；
陽性對照采用含有檢測序列的DNA（或質(zhì)粒）作為PCR反應(yīng)的模板,。
7.2.3 PCR擴增反應(yīng)體系
試劑 | 反應(yīng)體積 |
dH2O | 12.8 μL |
10× Buffer. MgCl2 | 2.0 μL |
dNTPs | 0.8 μL |
混合引物 | 2.0 μL |
模板 | 2.0 μL |
Taq 酶 | 0.4 μL |
總體積 | i. μ |
| L |
7.2.4 PCR反應(yīng)程序
預(yù)變性 | 94℃ | 5 min； |
變性 | 94℃ | 30 sec,， |
退火 | 56℃ | 40 sec,， |
延伸 | 72℃ | 2 min，30個循環(huán),； |
終延伸 | 72℃ | 7 min,； |
保存 | 8℃ | —— |
7.2.5 電泳
用0.5.5c序制備1.5％的瓊脂糖凝膠（含EB或Goldview 0.5μg /mL）。取5μL產(chǎn)物點樣（可包括適量上樣緩沖液）,，用DNA分子量標(biāo)記物做參照,，電壓100 V,，電泳50 min（根據(jù)實驗室儀器情況確定具體電泳條件）,。使用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行保存和分析,。
7.3 結(jié)果判定
陰性對照未出現(xiàn)條帶,，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶條件下,，如待測樣品出現(xiàn)749 bp大小的擴增條帶,，則可判定該菌株攜帶ctxAB基因,；未出現(xiàn)749bp大小的擴增條帶,，則可判定不攜帶ctxAB基因,。
如果陰性對照出現(xiàn)條帶和/或陽性對照未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶，本次待測樣品的結(jié)果無效,，應(yīng)重新進行試驗,，并排除污染因素。