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一)準備和安裝過濾器  
清洗好過濾器,，干燥,，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好,，15磅20 min進行高壓滅菌處理,。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中,，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中,。用泵過濾，過濾后要檢查濾膜是否完好無損,。 

(二)合成培養(yǎng)基的配制 
1,、根據(jù)細胞目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yǎng)基干粉,，用適量超純水充分溶解,。

培養(yǎng)基	品牌	貨號
培養(yǎng)基	品牌	貨號
D-MEM/F-12	GIBCO	12400024
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), powder (high glucose)	GIBCO	12800017
F-12 Nutrient Mixture (Ham) powder	GIBCO	21700075
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) powder	GIBCO	12200036
Leibovitz's L-15 Medium powder	GIBCO	41300039
McCOY's 5A	SIGMA	M4892
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) with ribonucleosides and deoxyribonucleosides	GIBCO	11900024
Minimum Essential Medium (MEM) Alpha Medium powder (MEMα) without ribonucleosides and deoxyribonucleosides	GIBCO	12000022
Minimum Essential Medium (MEM) powder	GIBCO	41500034
NUTRIENT MIXTURE F12 HAM KAIGHN'S MODIFICATION (F12K)	SIGMA	N3520
RPMI Medium 1640	GIBCO	31800022
EGF	SIGMA	E9644
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256-25G
MEDIUM 199, WITH EARLE'S SALTS AND L-GLUTAMINE, WITHOUT SODIUM BICARBONATE. CELL CULTURE TESTED	SIGMA	M5017

2、 按要求添加碳酸氫鈉,、谷氨酸鈉,、HEPES等，充分攪拌使之溶解,。 
3,、 調(diào) pH至7.2左右。 
4,、 加水至終體積,。 
5、 在超凈臺中對溶液進行濾過除菌,，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中,，用翻帽塞塞緊瓶口,。 
6、 瓶口封好,，4℃冰箱貯存,。

  (三)小牛血清的處理 
市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理,，即通過加熱的方法破壞補體(近來也有觀點認為熱滅活處理是不必要的),。胎牛血清不必滅活。 
1,、 將血清加熱至56℃并保持30 min,，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻,，防止沉淀析出,。 
2、 處理后的血清貯存于4℃,。 
3,、 小牛血清在使用前好進行篩選以掌握血清的質量。 

(四)生長培養(yǎng)基的配制 
除無血清培養(yǎng)之外,，各種合成培養(yǎng)基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素,。 
1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用,，翻帽塞塞緊瓶口,。 
2、按如下比例配制： 基本培養(yǎng)基占80％~90％,，小牛血清或胎牛血清占10％~20％,。 按1％體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL,，,。 

(五)凍存細胞的復蘇 
1、應遵守慢凍快融的原則,。先將水浴鍋調(diào)至37-37。5度,，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化,。 
2、將解凍后的細胞液在常溫條件下,，1000rpm離心5分鐘,。 
3、棄上清,，用少量培養(yǎng)基將細胞懸起,，將細胞懸液轉移至事先加入5ml*培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中,。將細胞混勻后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

 (六)傳代: 
1,、貼壁細胞: 
對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養(yǎng)基，吸的越干凈越好,，以免中和后加入的消化液,，使強度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml,，按此比例進行消化,，(根據(jù)經(jīng)驗)，晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘,，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml*培養(yǎng)基后,，輕輕吹打,，使細胞基本成單個懸浮，然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),，加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或實驗,。 
2、懸浮細胞: 
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi),，加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入*培養(yǎng)基,，輕輕吹勻后,，分置其它培養(yǎng)瓶內(nèi)加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 

(七)凍存 
將貼壁細胞消化后離心收集,，懸浮細胞直接離心收集,，以*培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO,。以每管1～2ml分裝至凍存管中,。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中,。 

(八)注意事項 
1,、玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140度2小時以上; 
2、無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,，紫外線照射40分鐘以上;各種培養(yǎng)板照射3小時以上; 
3,、培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物,。分裝后置4度保存; 
4,、消化液(pH7.8)或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,，分裝成支置-20度保存; 
5,、培養(yǎng)箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌),。至少每月一次,。 
6、進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,，然后用75%酒精擦拭,，操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,，如果數(shù)量較多,，培養(yǎng)瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離,，開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,，打開后應用燈先燒口，然后燒蓋,。用完后同樣操作,。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。

 

干細胞培養(yǎng)基本方法

MEF P0細胞培養(yǎng)Protocol

復蘇：

1. 將MEF P0細胞凍存管從液氮中取出,，置于37℃水浴中使之迅速融解,，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染,。
2. 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),，以1000 rpm，離心5 min,。
3. 離心后將上清液吸除,，另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮,。
4. 輕輕吹打,，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡,。
5. 按照MEF細胞說明書上建議的復蘇培養(yǎng)體系轉移至1個T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),，加入培養(yǎng)液14 ml。
6. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),。
7. 復蘇第二天觀察，如死細胞較多,，更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液,，可以使細胞生長的更好,。

傳代：

1. 待細胞長到90%-100%滿時進行傳代，一般3-4天,，具體視細胞生長情況而定,。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍,。
4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶,，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面,，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞,。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要1-2 min）,。
6. 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化,。
7. 多次輕輕吹打細胞，制成單細胞懸液,。
8. 按照1:2-1:3的比例進行傳代,。
9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

凍存：

1. 按傳代的方法將細胞消化下來,，制成細胞懸液,。
2. 以1000 rpm，離心5 min,，棄上清,，逐滴加入已經(jīng)預冷的凍存液，懸浮細胞,。
3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內(nèi),，標記細胞名稱、代數(shù),、凍存日期等基本信息,。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過夜,，轉入液氮,。

凍存液配方： 
MEF*培養(yǎng)液80%，F(xiàn)BS10%,，DMSO 10%

si lie霉素c處理：

1. 一般地,，P0代MEF細胞傳至P3代時，可以進行絲裂 ,，霉素C（Sigma,，M0503）處理。處理過后的MEF細胞不再增殖，可直接作為feeder使用,。
2. 傳至P3代的MEF細胞長至80%以上時,，吸出舊的MEF*培養(yǎng)液，加入含絲裂,，霉素C（終濃度10 mg/ml ）的新鮮MEF*培養(yǎng)液（以T75培養(yǎng)瓶為例,，加入培養(yǎng)液的體積為10ml ）。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時,。
3. 吸出培養(yǎng)液,，用PBS快速洗4遍以去除殘余的絲裂 ，霉素C,。
4. 消化細胞,、細胞計數(shù)并凍存。一般地,，一個T25培養(yǎng)瓶鋪1´106細胞,。