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細(xì)菌的生理,、生化試驗(yàn)簡介
閱讀：548 發(fā)布時(shí)間：2021-1-5微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物,，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物,。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一,微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)介紹如下：
一,、糖酵解試驗(yàn)
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用,，能利用者,，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn),。
試驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許,，接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管中,，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種,。接種后,，置36±1.0°C培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果,，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸）,，小倒管中有無氣泡,，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基,，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,，有時(shí)還可看出接種菌有無動(dòng)力，若有動(dòng)力,，培養(yǎng)物可呈彌散生長,。本試驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,，從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,，因而每次試驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管,。一般常用的指示劑為酚紅,、溴甲酚紫，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑,。
二,、淀粉水解試驗(yàn)
某些細(xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖,。淀粉水解后,，遇碘不再變藍(lán)色。
試驗(yàn)方法：以18~24h的純培養(yǎng)物,，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)接種，試驗(yàn)數(shù)種培養(yǎng)物）或直接移種于淀粉肉湯中,，于36±1°C培養(yǎng)24~48h,，或于20℃培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面,，若為液體培養(yǎng)物,，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果,，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色,、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化,。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色,。
淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力,、培養(yǎng)時(shí)間,，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性,，以pH7.2適,。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,，因而以臨用時(shí)制備為妥。
三：V-P試驗(yàn)
某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,，丙酮酸縮合,，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,，被空氣中的氧氧化為二乙酰,，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應(yīng),。
試驗(yàn)方法：
?。保?/span>O’Meara氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)48h,，培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml,，搖動(dòng)試管1~2min，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,，若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅,，即判定為陰性。亦有主張?jiān)?/span>48~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者,。
?。玻?/span>Barritt氏法：將試驗(yàn)菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)4天,、培養(yǎng)液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,，搖動(dòng)2~5min，陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色,，若無紅色出現(xiàn),，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色,、可判定為陰性,。
３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中,、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán),，乳化接種于其中，加入5%α-萘酚3滴,，40%氫氧化鈉水溶液2滴,，振動(dòng)后放置5min，判定結(jié)果,。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用,。
本試驗(yàn)一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí),，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生,，故應(yīng)省去或以氯化鈉代替,。
四：甲基紅（Methyl Red）試驗(yàn)
腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,，進(jìn)一步分解中,，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸,，琥珀酸,、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,，使甲基紅指示劑變紅,。
試驗(yàn)方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基,，培養(yǎng)于36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天,，從第二天起，每日取培養(yǎng)液1ml,，加甲基紅指示劑1~2滴,，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色,，陰性為黃色,。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果,。
甲基紅為酸性指示劑,，pH范圍為4.4~6.0，其pK值為5.0,。故在pH5.0以下,，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0以上,，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0或上下接近時(shí),，可能變色不夠明顯,，此時(shí)應(yīng)延長培養(yǎng)時(shí)間，重復(fù)試驗(yàn),。
五：靛基質(zhì)（Imdole）試驗(yàn)
某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來,。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合,，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物,。
試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管,，于36±1°C培養(yǎng)24h時(shí)后,，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑2~3滴,，輕搖試管,，呈紅色為陽性，或先加少量乙迷或二甲苯,，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì),，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,，在接觸面呈紅色,，即為陽性。
實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng),，若先用二甲苯或乙迷等進(jìn)行提取,，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,，因而結(jié)果更為可靠,。
六、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力,，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,、氨或氮?dú)獾取喯跛猁}的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn),。
試驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合,、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面,，立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗(yàn)陽性,，若無紅色出現(xiàn)則為陰性。
用α-萘胺進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),，陽性紅色消退很快,、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照,。α-萘胺具有致癌性,、故使用時(shí)應(yīng)加注意。
七,、明膠（Gelatin）液化試驗(yàn)
有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶）,，能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸,，失去凝膠性質(zhì)而液化,。
試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點(diǎn)種于平板培養(yǎng)基,。于20~22℃培養(yǎng)7~14天,。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃,。每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動(dòng),、靜置冰箱中待其凝固后,、再觀察其是否被細(xì)菌液化，如確被液化,，即為試驗(yàn)陽性,。平板試驗(yàn)結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，若為陽性,，10~20min后,，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性,。
八,、尿素酶（Urease）試驗(yàn)
有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解,、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨,，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色,。尿素酶不是誘導(dǎo)酶,，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖冢?xì)菌均能合成此酶,。其活性適pH為7.0,。
試驗(yàn)方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均,，于36±1℃培養(yǎng)10,，60和120min，分別觀察結(jié)果,?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部,，留底部作變色對照,。培養(yǎng)2，4和24h分別觀察結(jié)果,，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作終判定,，變?yōu)榉奂t色為陽性,。
九、氧化酶（Oxidase）試驗(yàn)
氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化,，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng),。
試驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色,。陰性者無顏色改變,。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果。
十,、硫化氫（H2S）試驗(yàn)
有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物,，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物,。
試驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中,，沿管壁穿刺接種，于36±1℃培養(yǎng)24~28h,，培養(yǎng)基呈黑色為陽性,。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯,，再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空,，以不會(huì)被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天,。紙條變黑為陽性,。
十一、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物,，穿刺接種并涂布于斜面,，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果,。
本試驗(yàn)可同時(shí)觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）,；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,，但因量少,，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化,，加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅,，底部由于是在厭氧狀態(tài)下,，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。
十二,、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力（SIM）瓊脂試驗(yàn)
試驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度,，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果,。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性,，混濁或沿穿刺線向外生長為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面,，靜置10min,，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部,，可作為對照,。
本試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效,。