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IHC實驗疑難解析大匯總
閱讀：595 發(fā)布時間：2020-12-28本周小編將帶來IHC系列培訓(xùn)的，后一講,，IHC實驗中各種常見問題的原因分析和解決方案,。希望通過本次課程,，您可以了解到 IHC 實驗中出現(xiàn)異常情況時您可采取的措施。
一,、切片無染色
IHC 中可能遇到的一個主要問題是無染色,。出現(xiàn)這一問題的原因主要有三個：
蛋白表達(dá)量低/無表達(dá)
樣本制備不良
試劑/方案問題
1、表達(dá)量低/無表達(dá)
了解目標(biāo)蛋白表達(dá)的種屬特異性和組織特異性,，有時候目標(biāo)蛋白在一些常見種屬(如：人)有表達(dá),，并不表示在其他種屬上也有表達(dá)。
解決方案：
在實驗前查詢文獻(xiàn),，確定您待檢測的目標(biāo)種屬和組織的表達(dá)量情況,；；
在實驗方案中添加陽性對照組織樣本,，驗證實驗體系的正確性,；
陽性對照的細(xì)胞系，一些情況下,，可以選擇確定會表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系作為陽性對照,；
質(zhì)量優(yōu)良的抗體說明書上會給出建議的陽性對照樣本，可以作為參考,。
圖1,、人體不同組織的表達(dá)分布，來源：
2,、樣本制備不良
固定步驟：過度固定組織或固定時間不夠,；固定時使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑可能會遮蔽抗體識別的表位。
解決方案：
用不同的抗原修復(fù)方法暴露表位（用 pH 6 或 pH 9 緩沖液熱修復(fù),、酶修復(fù)等）,。
如果過度固定，則需要縮短固定時間,。
可能脫蠟不充分
解決方案：
延長脫蠟時間,，且需要使用新鮮二甲苯。
圖2 ,、不同修復(fù)液對染色效果的影響
3,、試劑/方案問題
一抗問題：
濃度太低：按照說明書上的建議，梯度稀釋抗體后實驗,，選擇合適的濃度,。
孵育時間不夠：嘗試在 4°C 孵育更長時間（例如過夜）。
抗體可能不適用于IHC應(yīng)用,，因為其可能無法識別蛋白質(zhì)的天然（3D）構(gòu)象,。
檢查抗體數(shù)據(jù)表，查看其是否在 IHC 中得到了驗證及其 IHC 的類型（石蠟切片、冰凍切片等）,?？贵w在免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）或免疫沉淀（IP）中的成功使用暗示了抗體能夠識別蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。
二抗問題：
使用的二抗為抗一抗宿主的抗體（例如,，如果在兔中生產(chǎn)一抗,，則使用抗兔二抗）。檢查一抗的亞型是否被二抗識別,。
用其他蛋白的一抗檢測二抗效果,，確保二抗正常使用。
二,、高背景
免疫組化染色之后的高背景是困擾很多實驗者的常見現(xiàn)象,，如果您遇到類似問題，可以對照下表的分析,，嘗試相應(yīng)的解決方案,。
可能的問題原因 | 解決方案 |
沒有封閉或封閉不足 |
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一抗?jié)舛瓤赡苓^高 | 滴定抗體至濃度，進(jìn)一步稀釋抗體并在 4℃ 孵育（緩慢孵育,，但有針對性地結(jié)合效果）,。
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孵育溫度可能過高 |
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二抗可能是非特異性結(jié)合 |
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組織沖洗不充分，仍殘留固定劑 |
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內(nèi)源性過氧化物酶具有活性 |
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檢測系統(tǒng)是熒光顯微鏡,，固定過程引起自發(fā)熒光 |
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信號擴(kuò)增過多（間接技術(shù)） |
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應(yīng)用過多底物（酶檢測） |
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色原與組織樣本中PBS 反應(yīng)（酶檢測） |
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通透破壞細(xì)胞膜并去除膜蛋白（膜蛋白） |
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三、非特異性染色
非特異性染色也是小編在日常工作中被問到頻率較高的問題,，希望下面這些建議一次性解答您的各種疑問,。
一抗/二抗?jié)舛瓤赡苓^高。
嘗試降低抗體濃度和/或縮短孵育期,?？梢耘c不表達(dá)靶蛋白的陰性組織進(jìn)行比較。
內(nèi)源性過氧化物酶具有活性,。
用酶抑制劑,，使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶，或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制過氧化物酶,。
一抗是抗染色組織來源物種的抗體（例如在小鼠組織樣本上使用小鼠一抗）,。當(dāng)應(yīng)用二抗時，其與組織樣本結(jié)合,，因為其為抗該種屬抗體,。
使用的一抗為針對與您組織來源物種不同物種的抗體。
使用商業(yè)化試劑盒（例如,，mouse on mouse 試劑盒：ab127055),。
切片/細(xì)胞已經(jīng)干燥。
將切片/細(xì)胞保持在高濕度下以防變干,。
總結(jié)
您現(xiàn)在應(yīng)該已經(jīng)*了解了 IHC 的常見疑難問題知識,，包括：
1、切片無染色的原因及解決方法,；
2,、遇到高背景染色結(jié)果時的處理方案；
3,、排除非特異性染色時的做法,。
希望您通過這次系列培訓(xùn)了解所有相關(guān)實驗知識，使您可以順利完成所有實驗,。IHC 的培訓(xùn)到這里就結(jié)束了,。請務(wù)必把這些信息保存在安全的地方，以備日后參考,。