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蛋白質(zhì)印跡（Western Blot, WB）又稱為免疫印跡（Immunoblot）,，是利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將樣品中分子量大小不同的蛋白分開(kāi),，然后通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白定量地遷移并幾乎原位復(fù)制、固定到固相膜上,，再利用抗原,、抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，特殊的抗體標(biāo)記技術(shù)以及相應(yīng)的檢測(cè)方法,，進(jìn)而對(duì)目的蛋白進(jìn)行定性、相對(duì)定量檢測(cè)的技術(shù),。此項(xiàng)技術(shù)誕生于上世紀(jì)七十年代,，近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)經(jīng)久不衰。

WB實(shí)驗(yàn)流程分為樣本采集,，蛋白樣品制備,，上樣，凝膠電泳,，轉(zhuǎn)膜,，封閉，一抗孵育,，洗膜,，二抗孵育，洗膜,，顯色（信號(hào)檢測(cè)）,。作為一名實(shí)驗(yàn)汪是不是近又到體無(wú)完膚？今天來(lái)和大家聊聊應(yīng)用廣泛幾乎人人都曾中槍的Western Blot實(shí)驗(yàn)—樣本采集和蛋白制備的相關(guān)知識(shí)和技巧,。

 

一

樣本采集和保存

1. 對(duì)于動(dòng)物組織和植物器官,，樣本較多或取樣時(shí)間間隔太長(zhǎng)則需先將樣本放入液氮速凍冷存；若未能及時(shí)進(jìn)行蛋白樣品制備,，可液氮速凍后,，存入-80℃保存約六個(gè)月或浸入液氮罐保存約一年,。

2. 對(duì)于細(xì)胞和一些微生物樣本，可去除培養(yǎng)基后,，加裂解液制備蛋白樣品,；若未能及時(shí)制備蛋白樣品，去除培養(yǎng)基后,，將其液氮速凍后保存于-80℃（約一個(gè)月）或保存于液氮（約三個(gè)月）,。

3. 所有樣本均不建議保存于-20℃。-20℃時(shí),，組織,、細(xì)胞內(nèi)的水會(huì)結(jié)晶，細(xì)胞活性和組織微觀結(jié)構(gòu)會(huì)受到傷害,，生物大分子受到組織,、細(xì)胞內(nèi)多種因素的影響，穩(wěn)定性可能會(huì)降低,。

 

二

蛋白提取

一般為了提取到足夠的蛋白以及更容易地提取蛋白,，需要準(zhǔn)備足夠量的樣本，要求樣本量為細(xì)胞>10⁶個(gè),，組織>30mg,，菌體濕重>10mg，植物>100mg,，血清>50µL,。蛋白提取的原則：低溫快速，裂解充分,。

下面對(duì)一些常用樣本的蛋白提取過(guò)程進(jìn)行簡(jiǎn)單描述：

1. 細(xì)胞樣本

一般樣本為1×10⁶～1×10⁷個(gè)細(xì)胞,，根據(jù)細(xì)胞量多少或不同細(xì)胞中蛋白含量的多少所加裂解液的量也不相同，一般1×10⁶個(gè)細(xì)胞,，加裂解緩沖液100~200µL,，具體實(shí)驗(yàn)操作時(shí)參照以上比例，可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,。

1) 懸浮細(xì)胞：收集培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞,，4℃條件下1000~3000rpm，離心3~5min,，留下細(xì)胞沉淀,，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，然后用預(yù)冷的0.01M PBS（即1×PBS）輕洗2次,，4℃條件下1000~3000rpm,，離心3~5min，去除上清，取用細(xì)胞沉淀,，按照上述參考比例加入適量裂解緩沖液,，吹打混勻，冰上裂解15~30min,。

2) 貼壁細(xì)胞：直接去除培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用預(yù)冷的1×PBS輕洗2次，去除PBS,，加入適量裂解緩沖,，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，連同裂解緩沖液一起收集,，吹打混勻,，冰上裂解15~30min?；蛘哌€有一種方法是直接用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞,，連同培養(yǎng)基一起收集，后續(xù)過(guò)程同懸浮細(xì)胞,；再有一種方法,，是用胰酶消化細(xì)胞后，收集細(xì)胞,，離心沉淀,，用預(yù)冷的PBS輕洗細(xì)胞沉淀，后續(xù)過(guò)程同懸浮細(xì)胞,，但胰（蛋白）酶消化的方法不適用于目的蛋白為細(xì)胞膜上的膜蛋白,，會(huì)造成影響。

2. 組織樣本

一般動(dòng)物組織樣本,，按照1mg組織加入10µL裂解液的比例進(jìn)行添加，不同的組織蛋白含量也不同,，需要調(diào)整添加量,。去除組織樣本上的脂肪（可用預(yù)冷的眼科剪、鑷子去除）,、血液（用預(yù)冷的PBS清洗）等雜質(zhì),，防止造成污染，產(chǎn)生干擾,。然后對(duì)處理好的樣本,，加入裂解緩沖液，用預(yù)冷的眼科剪在冰上將其剪碎,，可以加入鋼珠后,，高速振蕩研磨儀進(jìn)行破碎。對(duì)于骨、肌肉,、皮膚,、尾巴、韌帶組織等或硬度大或韌性強(qiáng)的樣本,，可以先試著剪碎,，再進(jìn)行液氮研磨后加入適量裂解液。組織樣本處理后,，冰上放置15~30min,。

3. 冰上放置裂解的同時(shí)，需要加入適量蛋白酶抑制劑來(lái)減少蛋白酶的水解作用,，磷酸化蛋白的提取還需要加入蛋白磷酸酶抑制劑,。

4. 冰上放置裂解后，建議再進(jìn)行超聲處理,，經(jīng)過(guò)超聲處理,，裂解更充分。

5. 如有特殊的樣本或者特殊的目的蛋白,，常規(guī)方法難以提取,，建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參照文獻(xiàn)上的配方和步驟提??；若后未找到相關(guān)資料，可購(gòu)買商品化的試劑盒,。