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1．固定：,。好用4%的多聚甲醛固定液,。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好,；但對于不同的組織和抗原,，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液,，請于購置前注意說明書,。

Bouin S固定液：飽和苦味。酸750ml,，甲醛250ml,，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強(qiáng),，固定較好,，結(jié)構(gòu)完整,，但因偏酸，對抗原有一定損害,，且組織收縮明顯,，不適于組織標(biāo)本的長期保存。
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,，適于固定石蠟切片,。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好,。

2．組織脫水,，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片,，切不完整,。

3．切片時展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/p>

4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜,，溫度太高或時間太長,，抗原容易丟失。

5．蠟塊及切片的保存：,。好在4℃保存

6．脫片問題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中,。常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,，適合于需要酶消化,、微波、高溫高壓的防脫片處理,。如不行,，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,，可用如下方法：切片在脫蠟前,，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干,，即可進(jìn)行下一步,。

7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活,。

8．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復(fù),，這將有助于暴露抗原決定簇,，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的。佳修復(fù)液請參閱抗體說明書),。對于不同的組織,，不同的抗原,，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣,，可進(jìn)行熱修復(fù),、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化,。膠原還可以用胃蛋白酶消化等,。

9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時,，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉

10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,，對于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11．背景高：在抗體濃度,、反應(yīng)時間,、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高,，可采用含1‰ Tween20的PBS洗,，特別是在顯色之前要多洗。

12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后,，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán),。

13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景,。

14．在整個操作過程中,，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色,。