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作者：    日期：2016-08-15

一,、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1,、清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)及儀器

2、開(kāi)啟冷凍切片機(jī)并將冷凍切片機(jī)預(yù)降至所需溫度（- 15~-20 ℃*）

3,、準(zhǔn)備好處理好的載玻片,、刀片,、膠水以及藥品

二、取材

解剖之后迅速取出所需的新鮮組織,，用干紗布或?yàn)V紙擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡,使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位,。

注：取材中目的標(biāo)本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應(yīng)避免不必要的脂肪及壞死組織附著;要盡量剔除毛發(fā),、硬骨或鈣化物;保乳手術(shù)切緣由于脂肪組織較多,取材厚度.好不要超過(guò) 3mm,，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整,。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織,。

三、冷凍切片

1,、取出組織支承器,，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑,，速放于冷凍臺(tái)上冰凍,，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（1~3分種）,。

2,、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上,，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵,，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平,。

3,、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定,，原則上是細(xì)胞密集的薄切,，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5 ～10μm間,。

4,、調(diào)好防卷板,。制作冰凍切片,，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心,，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好,，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r(shí),，以切出完整,、平滑的切片為準(zhǔn),。切好的組織在干凈的玻片上黏附時(shí)順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過(guò)程中皺折 ,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。

注：①包埋劑的選用：包埋劑是對(duì)冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素,，包埋劑用量要適宜,，過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑OCT劑,、B超藕合劑以及普通膠水,。B超藕合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。（OCT包埋劑驟冷時(shí)固化,，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近,，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點(diǎn),。）

②組織塊過(guò)?。合葘⑸倭磕z擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時(shí)將小組織放上,組織周圍再加一些膠,再次置于冷凍機(jī)中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質(zhì)量的切片。

③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低,，要根據(jù)不同的組織而定,。溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致組織塊過(guò)硬,切片碎裂,出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞;反之,溫度過(guò)高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考,。

④當(dāng)切片時(shí),，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái),，在室溫停留片刻,，再行切片，或者用口中哈氣,，或者用大拇指按壓組織塊,，以此來(lái)軟化組織，再行切片,。另者,，調(diào)高冰凍點(diǎn)。

⑤用于附貼切片的載玻片,，不能存放于冷凍處,，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí),，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差,，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別,，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí),，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起,。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片,，由于溫度相同,，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)象。