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CCCCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理性的原理
閱讀：957 發(fā)布時間：2020-12-11一、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）,。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細(xì)胞增殖和毒性分析,。
用途：藥物篩選,、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定,、腫瘤藥敏試驗
CCK8的優(yōu)點：
使用方便,，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑,；
CCK-8法能快速檢測,；
CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度,；
CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT法,；
CCK-8法對細(xì)胞毒性小,；
CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液,，毋需預(yù)制，即開即用,。
CCK8的缺點：
與MTT法相 比,，CCK8和XTT的價格比較貴。
CCK8試劑的顏色為淡紅色,，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。
與以往的增殖/毒性測定試劑相比較：
二,、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的方法
實驗一：細(xì)胞增殖分析
1,、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)
2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù),，每孔約100ul細(xì)胞懸液,，同樣的樣本可做3個重復(fù)。
3,、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時,，如果不需要貼壁，這步可以省去,。
4,、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少,，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入,。
5、培養(yǎng)1-4小時:細(xì)胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣,。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認(rèn).佳條件,。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）,。
6,、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,。
實驗二：細(xì)胞毒性分析
1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)
2,、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù),，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個重復(fù),。
3,、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁,，這步可以省去,。
4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)
5,、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時間,，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定,，起碼要一代以上的時間,。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少,，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
7,、培養(yǎng)1-4小時:細(xì)胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣,。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認(rèn).佳條件,。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）,。
8,、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,。
注：
若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化,。
如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話,，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基）,，去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基,，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
三,、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的注意事項
當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時,，貼壁細(xì)胞的小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低,，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基),。
酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,。
CCK8可以檢測大腸桿菌,，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染,，以免影響結(jié)果,。
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年,。
當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時,，培養(yǎng)板外一圈的孔容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差,。一般情況下,，外一圈的孔只加培養(yǎng)基,，不作為測定孔用。
在培養(yǎng)基中加入CCK8,，培養(yǎng)一定的時間,，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時,，還應(yīng)考慮藥物的吸收,，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間,，測定450 nm的吸光度作為空白對照,。
金屬對CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵,、硫酸銅會抑制5%、15%,、90%的顯色反應(yīng),，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話,，將會100%抑制,。
懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間,。