化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
糜蛋白酶（Chymotrypsin）試劑盒
閱讀：417 發(fā)布時間：2020-12-9糜蛋白酶（Chymotrypsin）試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,。
測定意義：
糜蛋白酶，又稱胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)。糜
蛋白酶的功能與胰蛋白酶相似,，但是具有分解能力強、毒性低和不良反應(yīng)小等優(yōu)點,。臨床上
糜蛋白酶用于痰液稀化,，對膿性和非膿性痰液均有效；也用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合,，如白
內(nèi)障摘除,。
測定原理：
糜蛋白酶催化 ATEE 水解,，產(chǎn)物在 237 nm 有特征光吸收；通過測定 237 nm 光吸收增加速
率,，來計算糜蛋白酶活性,。
自備儀器和用品：
臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、研缽、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、微量石英比色皿/96
孔板(UV 板),、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶,，4℃保存,。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存,。臨用前加入 20 mL 蒸餾水充分溶解,。
粗酶液提取：
組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,，
加入 1mL 試劑一）冰浴勻漿,，8000g，4℃離心 10min,，取上清,，即粗酶液。
測定步驟：
1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,，調(diào)節(jié)波長到 237 nm,，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于 37℃水浴中保溫 30min,。
3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μL 試劑一,，200μL 試劑二,，混勻于 237nm
測定 4min 內(nèi)吸光值變化，記為△A 空白管,。（從吸光值穩(wěn)定增加開始計時）
4. 測定管：取微量石英比色皿/96 孔板,，加入 20μL 粗酶液，200μL 試劑二,，混勻于 237nm
測定 4min 內(nèi)吸光值變化,，記為△A 測定管。（從吸光值穩(wěn)定增加開始計時）
注意：空白管只需要測定一次,。
糜蛋白酶活性計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加 1 為一個酶活單位,。
糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 測定管－△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A 測定管－△A 空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加 1 為一個酶活單位,。
糜蛋白酶（U/g）=(△A 測定管－△A 空白管) ×V 反總÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A 測定管－△A 空白管)÷W
W：樣品質(zhì)量（g）；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定,；V1：加入反應(yīng)體
系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10-2 mL,；V2：粗酶液總體積（mL）,，1 mL；V 反總：反
應(yīng)總體積,，220μL=0.22mL,； T：反應(yīng)時間（min），4min,。
b.使用 96 孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：25℃每毫克蛋白每分鐘催化吸光值增加 1 為一個酶活單位,。
糜蛋白酶（U/mg prot）= (△A 測定管－△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V1)÷T
=2.75×(△A 測定管－△A 空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義：25℃每克樣品每分鐘催化吸光值增加 1 為一個酶活單位。
糜蛋白酶（U/g）=(△A 測定管－△A 空白管) ×V 反總÷(W×V1÷V2)÷T
=2.75×(△A 測定管－△A 空白管)÷W
W：樣品質(zhì)量（g）,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體
系中粗酶液體積（mL）,，20μL=2×10-2 mL,；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL,；V 反總：反
應(yīng)總體積,，220μL=0.22mL； T：反應(yīng)時間（min）,，4min,。
注意事項：
臨用前配制的試劑配置好后 3 天內(nèi)使用完畢。