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紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒
閱讀：256 發(fā)布時(shí)間：2020-12-9
紅霉素-N-脫甲基酶（ERND）活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/48S
注意：正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的酶系,，在外源物質(zhì)代謝中,，尤其是藥物和毒物的
代謝，具有重要作用,。ERND 在 P450 酶系中相當(dāng)于 CYP2B 亞型,，與藥物代謝的去甲基化
密切相關(guān)。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用,，也可使
某些藥物經(jīng) CYP2B 代謝活化,。
測定原理：
ERND 催化紅霉素釋放甲醛，通過 Nash 比色測定甲醛含量,，即可計(jì)算出 ERND 活性,。
自備儀器和用品：
普通離心機(jī)，超速離心機(jī),、可調(diào)式移液槍,、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔
板,、蒸餾水和冰,。
試劑組成和配置：
試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加 100mL 蒸餾水溶解,。
試劑二：液體×1 瓶，4℃保存,。
試劑三：粉劑×1 管,，4℃保存,。臨用前加 1mL 蒸餾水,，充分溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶,，4℃保存,。臨用前加 0.5mL 蒸餾水，充分溶解,。
試劑五：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前,，加蒸餾水 4.5mL 充分溶解,。
試劑六：液體×1 瓶,，4℃保存。
試劑七：液體×1 瓶,，4℃保存,。
標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1 瓶，-20℃保存,。臨用前取 1.5mL EP 管,，加入 10μl 標(biāo)準(zhǔn)液，加 990μl 蒸餾
水,，混勻即為 0.05 mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液,，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1,、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約 0.5g 組織,，加入 1mL 試劑一,，冰上充分研磨，
10 000g 4℃離心 30min,，取上清液,，轉(zhuǎn)入超速離心管中。
2,、粗制微粒體：100 000g,，4℃，離心 60min,，棄上清液,。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1mL 試劑一,，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g
離心 30min，棄上清液,。
4,、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5mL，充分震蕩溶解,，即粗酶液,，待測。該
待測液需當(dāng)天使用,。
測定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,，調(diào)節(jié)波長到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min,。
3. 對照管：取 0.5mL EP 管,，加入 10μL 粗酶液，170μL 試劑二,，10μL 試劑三,，10μL 蒸餾
水，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min,；立即加入 35μL 試劑五,，混勻后置于冰浴中 5min；取
出后加入 35μL 試劑六,，混勻后室溫靜置 5min,；室溫 8000rpm 離心 5min；取新的 EP 管,，加
入 100μL 上清液,，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min,，然后取出,，用冷水冷卻 5min，
于 412nm 測定光吸收,，記為 A 對照管,。
4. 測定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μL 粗酶液,，170μL 試劑二,，10μL 試劑三，10μL 試劑
四,，混勻后置于 37℃水浴保溫 30min,；立即加入 35μL 試劑五，混勻后置于冰浴中 5min,；取
出后加入 35μL 試劑六,，混勻后室溫靜置 5min；室溫 8000rpm 離心 5min,；取新 EP 管,，加入
100μL 上清液，100μL 試劑七,，混勻后 60℃水浴 10min,，然后取出,，用冷水冷卻 5min,，于
412nm 測定光吸收，記為 A 測定管。
5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP 管,，加入 100μL 標(biāo)準(zhǔn)品,，100μL 試劑七，混勻后 60℃水浴 10min,，
然后取出,，用冷水冷卻 5min，于 412nm 測定光吸收,，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管,。
注意：每個(gè)樣品都需要做對照管。
ERND 活性計(jì)算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義：37℃下,，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×
稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T
= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。
(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義：37℃下,，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。
ERND 活性(nmol/min/g) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍
數(shù)÷（W×V 樣）÷T
= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4
L,；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上
清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另
外測定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；W：樣品質(zhì)量，g,；V 樣：加入粗酶
液體積,，10μL=0.01mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min）,，30min,。
b.使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下
(1). 按照蛋白濃度計(jì)算:
活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×
稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V 樣）÷T
= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr,。
(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:
活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生 1nmol 甲醛為 1 個(gè)酶活單位,。
ERND 活性(nmol/min/g) = C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍
數(shù)÷（W×V 樣）÷T
= 45×（A 測定管－A 對照管）÷A 標(biāo)準(zhǔn)管÷W
C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L,；V 標(biāo)準(zhǔn)品：100μL=1×10-4
L；稀釋倍數(shù)：V 反總÷V 上
清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另
外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒,；W：樣品質(zhì)量,，g,；V 樣：加入粗酶
液體積，10μL=0.01mL,； T：催化反應(yīng)時(shí)間（min）,，30min。