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 概述

       十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,，簡稱SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝膠電泳中。常用的一種蛋白表達(dá)</a>分析技術(shù),。此項(xiàng)技術(shù)的原理,，是根據(jù)檢體中蛋白質(zhì)分子量大小的不同,，使其在電泳膠中分離。在大腸桿菌表達(dá)純化外源蛋白的實(shí)驗(yàn)中,，SDS-PAGE更是*的操作,，其通常用于檢測蛋白的表達(dá)情況（表達(dá)量，表達(dá)分布）,，以及分析目的蛋白的純度等,。

 

       SDS-PAGE作用機(jī)理 
       蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現(xiàn)出不同的電荷,，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān),，我們在上樣前，通常會(huì)進(jìn)行一些處理(上樣緩沖液),。即在樣品中加入含有SDS 和β-巰基乙醇的上緩沖液,。SDS 即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一種陰離子表面活性劑,，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)； β-巰基乙醇是強(qiáng)還原劑,，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,。電泳樣品加入樣品處理液后，經(jīng)過高溫處理,，其目的是將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合,，以使蛋白質(zhì)*變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷,；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料,，用于監(jiān)控整個(gè)電泳過程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,，使加樣時(shí)樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部,。當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負(fù)極，下方為正極),，在凝膠中形成移動(dòng)界面并帶動(dòng)凝膠中所含SDS負(fù)電荷的多肽復(fù)合物向正極推進(jìn),。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS 多肽復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）,。 
       電泳啟動(dòng)時(shí),，蛋白樣品處于pH6.8 的上層，pH8.8 的分離膠層在下層,，上槽為負(fù)極,，下槽為正極。出現(xiàn)了 pH 不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)：啟動(dòng)時(shí)Cl¯解離度大,，Pro¯解離度居中,，甘 aaCOO¯解離度小,，遷移順序?yàn)椋╬H6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯與 Pro¯之間和 Pro¯與—COO¯之間都將出現(xiàn)低離子區(qū),，同時(shí)也出現(xiàn)高電勢，高電勢迫使 Pro¯向 Cl¯遷移,，—COO¯向 Pro¯遷移,。如：一個(gè) Cl¯領(lǐng)路，—COO¯推動(dòng),，蛋白在中間,，這樣就起到濃縮的作用了。在濃縮膠運(yùn)動(dòng)中,，由于膠聯(lián)度小,，孔徑大，Pro¯受阻小,，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上成層,，起濃縮效應(yīng)，使全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上,。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí),，此時(shí)Pro¯，Cl¯,，甘 aa 離子在 pH8.8 的溶液中,，Cl¯*電離而很快到達(dá)正極，甘 aa 電離度加大很快躍過蛋白質(zhì),，而到達(dá)正極,，只有蛋白質(zhì)分子在分離膠中較為緩慢的移動(dòng)。由于 Pro¯在電泳過程中,，受到溶液離子的變化而 pH 值發(fā)生變化,，但每一瞬間，其所帶電荷數(shù)除以單位質(zhì)量是不同的,，所以帶負(fù)電荷多者遷移快,，反之則慢，這就現(xiàn)了電荷效應(yīng),。由于膠孔徑小,，而且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對大分子阻力大,，小分子阻力小,，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中,，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異,，終達(dá)到彼此分開,。 

       PAGE 膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合，形成膠,，如下圖：

 

 

 

        注：催化劑：過硫酸銨（AP）在隔氧的狀態(tài)下,，。好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用新鮮的,。 
        加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺,。催化劑的作用是使單體聚合成網(wǎng)狀聚合物,。 

        SDS聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍： 

丙烯酰胺濃度（%）	線性分離范圍（KD）
15	10-43
12	12-60
10	20-80
7.5	36-94
5.0	57-212

        試劑及主要器材 
        通常在SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中用到以下幾種試劑： 
        1、主要試劑 
         30％凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g,，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g,，加雙蒸水至100mL。外包錫紙,，4℃冰箱保存,，30天內(nèi)使用。 
         分離膠緩沖液(1.5mol／L): Tris 18.17g,，加雙蒸水溶解,，6mol/L HCl調(diào)pH8.8，定容100mL,。4℃冰箱保存 
         濃縮膠緩沖液(0.5mol／L): Tris 6.06g,，加水溶解，6mol/L HCl調(diào)8,，并定容到100mL,。4℃冰箱保存 
         電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g,，Gly 14.4g,，加雙蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存,。 
         10％SDS,，室溫保存 
         質(zhì)量濃度10％過硫酸銨(新鮮配制) 
        上樣緩沖液：5mol／L Tris-HCl pH6.8  1.25mL，甘油2mL,，10％SDS 2mL,，β-巰基乙醇1mL，0.1％溴酚藍(lán)0.5mL,，加蒸餾水定溶至10mL,。 
        考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（1L）：1g考馬斯亮藍(lán)R250，加入450甲醇,，100ml冰醋酸 
        脫色液（1L）：100ml甲醇,，100ml冰醋酸 
        未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mg／mL )
        2,、實(shí)驗(yàn)器材
        垂直板電泳槽 
        電泳儀 
        長滴管及微量加樣器 
        燒杯(250mL、500m1),、量筒(500mL,、 250m1)、培養(yǎng)皿(375px´l125px) 
        槍頭（1ml,、200ul,、10ul） 

        注射器等

 

        SDS-PAGE所需溶液：  
        A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀酰胺0.8g,，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0,，過濾于棕色玻璃瓶中4℃貯存,。 
        B液——1.5mol/L  Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs堿,，溶于60mL（30mL）去離子水中,，加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，定容至100mL（50mL）,。 
        C液——1.5mol/L  Tris·HCl,，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs堿，溶于60mL（30mL）去離子水中,，加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8,，定容至100mL（50mL）。 
        D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去離子水中,，定容至100mL(20mL),，加熱至68℃助溶。 
        E液——10％過硫酸銨：5g(0.5g)過硫酸銨,，溶于50mL(5mL)去離子水中,；現(xiàn)配現(xiàn)用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。 
        F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液,，低溫保存,。 
        聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否,，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān),。 
 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9,，選擇TRIS-HCL系統(tǒng),。 
        TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑,，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行,。 
        十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑,，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵,、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用,、去多肽折疊。 

       注意： 丙烯酰胺具有很強(qiáng)的 神經(jīng)毒性 并可以通過皮膚吸收,，其作用具累積性,。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒,，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料,。

 

       SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程 
       1. 清洗玻璃板 
       一只手扣緊玻璃板,，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉  輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖,，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干,。 
       2. 灌膠與上樣
       玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠,。（操作時(shí)要使兩玻璃對齊,，以免漏膠。） 
       配 12％分離膠,，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠,。灌膠時(shí)，可用 3ml的吸管或10ml 槍吸取適量的膠沿玻璃放出,，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可,。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快,。（灌膠時(shí)開始可快一些,，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下,，這樣膠中才不會(huì)有氣泡,。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型,。）
      分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例,，配置12％的分離膠和5.1％的濃縮膠。 

試劑名稱	12%的分離膠（8塊,，35ml）	5.1%的濃縮膠（8塊,，12ml）
30%凝膠貯備液/ml	14	2
分離膠緩液（pH 8.8）/ml	8.75
濃縮膠緩沖液（pH 6.8）/ml		3
雙蒸水/ml	12.25	6.9
10%過硫酸銨/ul	175	100
TEMED/ul	15	10

       注：分離膠與濃縮膠的濃度計(jì)算公式： 
       A%*Va/V總 =C ，A%為30％凝膠貯備液， 
       例如,，12%的分離膠：0.3*10/25=12% 
       1.當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí),，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干,。 
       2.按前面方法配 5.1％的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠,。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生,。插梳子時(shí)要使梳子保持水平,。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小,，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠,。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出,。 
       3.用水沖洗一下濃縮膠,，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi),，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外,。） 
       4.測完蛋白含量后，計(jì)算含 50μg 蛋白的溶液體積即為上樣量,。取出上樣樣品至 0.5ml 離心管中,，加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過 15μl,，加樣孔的大限度可加 20μl 樣品,。）上樣前要將樣品于沸水中煮 5min 使蛋白變性。 
       5.加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣,。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡,。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出,。加入下一個(gè)樣品時(shí),，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3 次，以免交叉污染,。
       3. 電泳 
       加樣完畢,，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后,，樣品進(jìn)膠前電壓控制在100～200V,，大約15～20min；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后,，電壓升到200V,，電泳過程保持電壓穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1～50px處即停止電泳,，約0.5-1小時(shí),。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水,，降低電泳溫度,。 
       電泳。 
       4. 染色,、脫色 
       電泳結(jié)束后,，關(guān)掉電源，取出玻璃板,，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi),，用刀輕 輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開,，然后輕輕將膠片托起,，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)皿中染色,，使用0.25％的考馬斯亮藍(lán)染液,，染色2～4h，必要時(shí)可過夜,。 
       棄去染色液,，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液,，進(jìn)行擴(kuò)散脫色,，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止,。 
       5. 結(jié)果處理
       測量脫色后凝膠板的長度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離),，測量指示染料遷移的距離。 
       按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率(Rm)
       相對遷移率＝樣品遷移距離(cm)／染料遷移距離(cm) 
       標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標(biāo),，蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上做圖,，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 

       測定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量,。

 

 

 

        注意事項(xiàng)
        APS和TEMED是促凝的,，根據(jù)溫度加入的量是可以變動(dòng)，一般不超過30％,。 
        玻璃板一定要洗干凈,，否則制膠是會(huì)有氣泡。 
        聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,，操作時(shí)注意安全,，戴手套。（凝膠以后,，聚丙烯酰胺毒性降低,。） 
        凝膠的時(shí)間要嚴(yán)格控制好，一般在20-30min,。 
        點(diǎn)樣時(shí),，如果孔比較多，盡量點(diǎn)在中央,。（點(diǎn)在邊上時(shí),，跑出的帶是斜的） 
        點(diǎn)樣前要排盡膠底部的氣泡，防止干擾電泳,。 
        電泳結(jié)束后,，取膠時(shí)，小心把玻璃板翹起（防止再次落下）,。 
        脫色時(shí),，盡量多次進(jìn)行換水。 
        上樣量不宜太高,，蛋白含量每個(gè)孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl,。 
        做膠時(shí),，凝膠時(shí)間控制在25min。梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平,。 
        上樣時(shí),，Marker，好標(biāo)在中間,，邊上的孔盡量不要上樣,。 
        制膠時(shí)，在加APS前盡量不要攪拌,，加入APS后可以輕輕攪拌,，不要產(chǎn)生氣泡。 
        分離膠緩沖液的pH一定要準(zhǔn)確,，盡量在20℃左右調(diào)掉8.8 
        安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲,，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。 
        凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠,。注膠過程,，好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。 
        微,，量注射器（加樣器）上樣時(shí), 注射器不可過低,以防刺破膠體,；也不可過高, 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔,。 
        剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無損,染色要充分,。
        注意：溫度，時(shí)間,，光照,，APS和TEMED都會(huì)對凝膠產(chǎn)生影響