化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
多酚氧化酶試劑盒說(shuō)明書(shū) 微量法
閱讀：390 發(fā)布時(shí)間：2020-11-24多酚氧化酶（polyphenol oxidase,，PPO）試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是一種含銅的氧化酶,，
能使一元酚和二元酚氧化產(chǎn)生醌,，從而引起褐化，與果蔬加工,、茶葉品質(zhì)和組培等密切相關(guān),。
測(cè)定原理：
PPO 能夠催化鄰苯二酚產(chǎn)生醌，后者在 525nm有特征光吸收,。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔
板、研缽,、冰和蒸餾水,。
試劑組成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存,；
試劑一：20mL×1 瓶,，4℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶,，4℃保存；
試劑三：10mL×1 瓶，4℃保存,；
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10
4 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超
聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃
離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加
入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。
2,、血清（漿）或果汁樣本的處理：
按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清
（漿）或果汁加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟：
1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm，蒸餾水調(diào)零,。
2,、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）
試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管
試劑一 200 200
試劑二 50 50
樣本 50
煮沸的樣本 50
37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）中準(zhǔn)確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻
試劑三 100 100
充分混勻，10000g,，常溫離心10min,，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,，525nm
處檢測(cè)測(cè)定管和對(duì)照管吸光度,，計(jì)算 ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照,。
注意：每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管?？梢栽诓煌瑢?duì)照管中加入不同樣品的粗酶液,，然后集
中進(jìn)行 1min 沸水浴處理。
PPO 活性計(jì)算：
a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1,、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01
為一個(gè)酶活力單位,。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液
2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力
單位,。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)酶活力單位,。
PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個(gè)
酶活力單位,。
PPO（U/10
4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL,；V 液：加入血清（漿）或果汁體積,，0.1mL；V 樣：加入樣
本體積,，0.05mL,；V 樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)
濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn)。
b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1,、血清（漿）或果汁PPO活性
單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005
為一個(gè)酶活力單位,。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷V 液
2、組織,、細(xì)菌或細(xì)胞 PPO 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活
力單位,。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =160×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單
位,。
PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個(gè)
酶活力單位,。
PPO（U/10
4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =0.32×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.4mL,；V 液：加入血清（漿）或果汁體積,，0.1mL,； V 樣：加入
樣本體積，0.05mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，10 min；Cpr：樣本蛋白
質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500 萬(wàn)