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活性氧(ROS)化學(xué)熒光法試劑盒說明書
閱讀:8706 發(fā)布時(shí)間:2020-11-19活性氧(ROS)化學(xué)熒光法試劑盒說明書
一,、測(cè)定原理:
本試劑盒采用的 DCFH-DA(2,,7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針,,是迄今常用、靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針,。DCFH-DA 本身沒有熒光,,可以自由穿過細(xì)胞膜,當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,,會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酯酶水解為 DCFH(Dichlorofluorescin),。而 DCFH 不能通透細(xì)胞膜,從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi),。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有活性氧存在時(shí),,DCFH 被氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì) DCF(Dichlorofluorescein),其熒光在激發(fā)波長 502nm,發(fā)射波長 530nm 附近有大波峰,,其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比,。
二、試劑組成及保存(100T-500T):
1,、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO,,-20℃保存。
2,、1ml 活性氧供氫體,,4-8℃保存。
三,、組織樣本操作步驟:(可用激光共聚焦顯微鏡觀察,,也可用于流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀,、熒光分光度計(jì)測(cè)定)
1,、單細(xì)胞懸液制備:
活性氧(ROS)化學(xué)熒光法試劑盒說明書
方法 1、采用單細(xì)胞懸液制備儀制備單細(xì)胞懸液,。方法 2,、酶消化法:
方法 3、機(jī)械法(網(wǎng)搓法): 2,、加入熒光探針:
①,、取不進(jìn)行任何處理的細(xì)胞用 0.01M PBS 重懸,設(shè)為陰性對(duì)照管,。陽性對(duì)照管:用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀,同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞,,推薦該試劑的工作濃度為 20~100µM。
②,、樣本管:用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀,,細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/ml。
③,、37℃孵育細(xì)胞 30min~幾小時(shí),。通常為 30~60min 即可。
④,、收集孵育(探針標(biāo)記)后的單細(xì)胞懸液,,1000g,離心 5~10 分鐘,,去上清收集細(xì)胞沉淀,,用 PBS 洗滌 1~2 次。離心收集細(xì)胞沉淀用于熒光檢測(cè);
3,、熒光檢測(cè):
①,、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸,并用于檢測(cè),;
②,、波長設(shè)置:激發(fā)波長 500(500±15nm),發(fā)射波長 525 (530±20 nm),。也可按照 FITC 熒光檢測(cè)條件檢測(cè),。
③、結(jié)果以熒光度值表示,。
四,、細(xì)胞樣本操作步驟:(可用激光共聚焦顯微鏡觀察,也可用于流式細(xì)胞儀,、熒光酶標(biāo)儀,、熒光分光度計(jì)測(cè)定)
1、直接將探針加入培養(yǎng)液中:
活性氧(ROS)化學(xué)熒光法試劑盒說明書
①,、直接將 DCFH-DA 探針加入無血清培養(yǎng)基中:一般按照 1: 1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA(終濃度為 10µM),。去除培養(yǎng)液后,加入適當(dāng)體積稀釋好的 DCFH-DA,。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜,,通常對(duì)于 6 孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的 DCFH-DA 不少于 1ml。
②,、取一份不加探針,,只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管。陽性對(duì)照管:取一份已加入探針的細(xì)胞,,同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞,,推薦該試劑的工作濃度為 20~100µM。
③,、37℃孵育細(xì)胞 30min~幾小時(shí),,通常為 30~60min 即可,孵育時(shí)間長短與細(xì)胞類型,、刺激條件,、DCFH-DA 濃度有關(guān)。一般陽性對(duì)照在刺激細(xì)胞 30 分鐘左右,,即可觀察到明顯的綠色熒光,。
④、吸去培養(yǎng)液,,利用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打,,肉眼觀察瓶底由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明,,細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。
⑤,、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5ml 離心管中,。用無血清培養(yǎng)液或者 PBS 洗滌 2 次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH-DA,。1000rpm/min,,5min,吸凈上清后加入 PBS 重新懸浮細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定,。
⑥,、波長設(shè)置:激發(fā)波長 500(500±15nm),發(fā)射波長 525 (530±20 nm),。也可按照 FITC
熒光檢測(cè)條件檢測(cè),。
⑦、結(jié)果以熒光度值示,。
2,、先收集細(xì)胞,制備成細(xì)胞懸液后測(cè)定
①,、細(xì)胞收集:
- 貼壁細(xì)胞,,吸去培養(yǎng)液,利用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打,,肉眼觀察孔板底
部(瓶底)由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明,,細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。
b,、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5ml 離心管中,。用無血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 洗滌 2 次,
1000rpm/min,,離心 5min,,吸凈上清,留細(xì)胞沉淀用于測(cè)定,。
c、懸浮細(xì)胞按照常規(guī)方法離心(2000rpm/min,,離心 5min),,收集細(xì)胞沉淀,用無血清培養(yǎng)液或者0.01MPBS 洗滌 2 次,,1000rpm/min,,離心 5min,吸凈上清,,留細(xì)胞沉淀用于測(cè)定,。
②,、細(xì)胞重懸:細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/ml,一般有兩種方法:
a,、先加入無血清培養(yǎng)液或者 PBS 重懸細(xì)胞,,然后根據(jù)加入培養(yǎng)液或者 PBS 的體積,按照 10µM的初始濃度(做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定自身樣本適合濃度)加入探針,,
b,、先按照 10µM 的濃度將探針用無血清培養(yǎng)液或者 PBS 先稀釋好,然后用稀釋好的探針重懸上述細(xì)胞沉淀,,制備成細(xì)胞懸液,,
③、取一份不加探針,,只加入培養(yǎng)基或 PBS 的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管,。陽性對(duì)照管:取一份已加入探針的細(xì)胞懸液,同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞,,推薦該試劑的工作濃度為 20~ 100µM,。
④、37℃孵育細(xì)胞 30min~幾小時(shí),,通常為 30~60min 即可,,孵育時(shí)間長短與細(xì)胞類型、刺激條件,、DCFH-DA 濃度有關(guān),;每隔 3-5 分鐘顛倒混勻一下,使探針與細(xì)胞充分接觸,。
⑤,、收集孵育(探針標(biāo)記)后的單細(xì)胞懸液,1000rpm/min,,離心 5min,,吸凈上清,用 PBS 洗滌
1~2 次,,離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測(cè),。
⑥、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸,,并用于檢測(cè),。
⑦、波長設(shè)置:激發(fā)波長 500(500±15nm),,發(fā)射波長 525 (530±20 nm),。也可按照 FITC
熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。
⑧,、結(jié)果以熒光度值表 活性氧(ROS)化學(xué)熒光法試劑盒說明書